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Sep 08, 2023

インクレチン社

Metabolismo della natura (2023) citato

Nature Metabolism (2023)この記事を引用

19 オルトメトリック

メトリクスの詳細

インクレチンのグルコース依存性インスリン分泌性ポリペプチド (GIP) とグルカゴン様ペプチド 1 (GLP-1) は、栄養素摂取量に比例するインスリン応答を媒介して耐糖能を促進します1。 GLP-1 受容体 (GLP-1R) は、糖尿病および肥満の治療の薬物標的として確立されています 2 が、GIP 受容体 (GIPR) の治療可能性については議論の対象となっています。 チルゼパチドは、GIPR と GLP-1R の両方のアゴニストであり、2 型糖尿病と肥満の非常に効果的な治療法です 3,4。 しかし、チルゼパチドは細胞株やマウスモデルにおいてGIPRを活性化しますが、二重アゴニズムがその治療効果に寄与するかどうか、あるいはどのように寄与するかは明らかではありません。 膵島ベータ細胞は GLP-1R と GIPR の両方を発現しており、インスリン分泌はインクレチン アゴニストが血糖コントロールを改善する確立されたメカニズムです 5。 今回我々は、マウス膵島において、マウスGIPRにおける効力の低下により、チルゼパチドが主にGLP-1Rを介してインスリン分泌を刺激することを示す。 しかし、ヒト膵島では、GIPR 活性に拮抗すると、チルゼパチドに対するインスリン反応が一貫して減少します。 さらに、チルゼパチドは、ヒト膵島におけるグルカゴン分泌とソマトスタチン分泌を増強します。 これらのデータは、チルゼパチドが両方のインクレチン受容体を介してヒト膵島からの膵島ホルモン分泌を刺激することを示しています。

インクレチン軸は、健康な人における食後のインスリン分泌のほとんどを担っており、インクレチン効果の喪失は、2 型糖尿病患者の血糖コントロール障害の一因となります6。 これらの特性に基づいて、インクレチン軸は医薬品開発の魅力的な標的であり続けており、GLP-1R アゴニスト (GLP-1RA) は血糖と体重を低下させる強力で効果的な治療法として登場しています 7。 この薬物クラスの継続的な進化により、追加の G タンパク質共役受容体 (GPCR) を活性化するように操作されたインクレチン ペプチド配列を備えた、複数の受容体を活性化する単一ペプチドの開発が見られました8。 初期の単量体デュアル受容体アゴニストは GLP-1R と GIPR の両方を標的とし、2 つの受容体システム間の相乗効果は 10 年前に初めて報告されました。 マウスモデルでは、デュアルアゴニズムは、GLP-1RA 単独と比較して体重減少と血糖コントロールに優れた有効性を示し9、ベータ細胞 10、アルファ細胞 11、CNS（中枢神経系）12 におけるシグナル伝達を介して作用する GIPR の相加効果が提案されています。 13および脂肪細胞14。 有望な前臨床研究にもかかわらず、この最初のデュアルインクレチンアゴニストを反復使用した 12 週間の臨床試験では、GLP-1R モノアゴニストと比較した優位性を実証できず 15、ヒトにおける多受容体戦略について疑問が生じました。

チルゼパチドは両方のインクレチン受容体のアゴニストであり、ヒト GIP (hGIP) ペプチド配列から設計されています。 平均半減期は約 5 日で、週に 1 回の投与が可能です5。 チルゼパチドは不均衡なアゴニストであり、培養細胞系において GLP-1R よりも高い程度で GIPR に関与します。 さらに、GIPR ではネイティブ GIP のシグナル伝達を模倣する in vitro 薬理学的プロファイルを持っていますが、GLP-1R ではβ-アレスチンの動員よりもサイクリック AMP (cAMP) 生成に有利に働くように偏っています 16。 臨床試験では、チルゼパチドによる治療は、GLP-1RA と比較して優れた体重減少と血糖コントロールをもたらしました 3,17 。これは、GIPR と GLP-1R の両方でのアゴニズムが 2 型糖尿病のヒトにおいて有益であることを示唆しています。 しかし、競合結合アッセイ、トランスフェクト受容体を用いた細胞ベースの実験、およびトランスジェニックマウスの研究において、チルゼパチドがGIPRに関与するという強力な証拠にもかかわらず、チルゼパチドがその実質的な薬理効果の一部としてヒトにおいてGIPRを直接活性化するという機能的証拠はほとんどない。

ここで我々は、チルゼパチドがヒトのGIPRを直接活性化するかどうかを評価するのに独特に適した実験的アプローチである、一次島におけるチルゼパチドを用いた実験の結果を報告する。 ベータ細胞インクレチン受容体の活性は、GLP-1R または GIPR アゴニストに対する抗糖尿病応答の必須要素であるインスリン分泌を促進します 10,18。 さらに、ベータ細胞は両方のインクレチン受容体を発現する数少ない細胞型のうちの 1 つであり、GIPR 対 GLP-1R シグナル伝達の相対的な重要性をテストするためのモデルを提供します。 GLP-1 配列はげっ歯類とヒトの種全体で保存されていますが、GIP 配列は種間で異なります。 チルゼパチドは、hGIP 配列から操作されます5。 重要なことに、hGIP は mGIPR19 での効力が低下しており、チルゼパチドも mGIPR20 での効力が低下していることが示唆されています。 したがって、我々の最初の調査は、ティルゼパチドの作用を研究するためにマウスモデルを使用することの潜在的な限界を特定するために、mGIPRにおけるティルゼパチドの効力の包括的な分析を提供することを目的とした。 我々は、4 つの相補的なアプローチを使用して、mGIPR における mGIP、hGIP、およびチルゼパチドの標的結合を評価しました。(1) リガンド結合アッセイ。 (2) GαS の採用。 (3) G タンパク質の活性化。 (4) cAMP の生成 (表 1)。 全体として、チルゼパチドの親和性 - 効力プロファイルは、mGIPR では mGIP と比較して 3 ～ 60 倍弱く、mGLP-1R では GLP-1 と比較して効力は同等かわずかに低下しました (拡張データ表 1)。 ヒトインクレチン受容体のチルゼパチド活性化に関するこれまでの測定では、hGLP-1R16 と比較して hGIPR の効力が増加していることが実証されました。 これらの初期の研究に基づいて、チルゼパチドは天然の hGIP と同様に hGIPR に作用しますが、天然の GLP-1 とは異なるパラメータで hGLP-1R に関与すると結論付けられました。 ただし、このプロファイルは、チルゼパタイドとマウスインクレチン受容体との相互作用では異なるようです。 たとえば、チルゼパチドとGLP-1はmGLP-1Rでは同様に挙動しますが、チルゼパタイドはmGIPRではmGIPよりも強力ではありません。 これは、チルゼパチドの不均衡な活性が実際にマウスβ細胞におけるGLP-1Rシグナル伝達を促進する可能性があることを示唆しており、マウスモデルを用いた実験でこの化合物を使用する場合には注意が必要であることを示唆している。

各インクレチン受容体におけるチルゼパチドの機能的重要性に取り組むために、マウスのインスリン分泌に対する機能喪失アプローチの影響を調査しました。 我々はまず、ベータ細胞のGiprを選択的に欠失させたマウスから単離した膵島を、GLP-1Rアンタゴニストexendin(9-39)と組み合わせて使用​​した(Ex9)。 チルゼパチドは、対照膵島において濃度依存的に（0〜100 nM）インスリン分泌を刺激しました（図1a）。 しかし、対照島と比較して、ベータ細胞Giprノックアウト島はチルゼパタイドに応答してより多くのインスリンを分泌しましたが（図1a）、Ex9は対照島とノックアウト島の両方でチルゼパタイドに応答したインスリン分泌を完全にブロックしました（図1a）。 我々は、ノックアウト膵島における応答の増強は、さまざまな GIPR ノックアウト モデルで以前に記載されている GLP-1R シグナル伝達の代償的な増強に起因すると推論しました 10、21、22。 この問題を回避するために、次にマウス膵島におけるインクレチン受容体の急性薬理学的拮抗作用を使用しました。 我々は、最近検証された長時間作用型GIPRアンタゴニスト23を適用しました。これにより、野生型マウスにおけるアシル化GIPRアゴニストに反応した血糖降下が防止されました（拡張データ図1a）。 Ex9によるGLP-1Rの拮抗作用は、チルゼパタイドに応答したインスリン分泌を妨げたが、GIPRアンタゴニストの存在は、単独またはEx9と組み合わせても、チルゼパタイド刺激によるインスリン分泌に影響を及ぼさなかった（図1b）。 これらの発見は、チルゼパチドが主に GLP-1R を介して作用して、マウス膵島におけるインスリン分泌を刺激することを示唆しています。 耐糖能に対するこれらの所見の影響を決定するために、GLP-1R24またはGIPRのアシル化アンタゴニストを単独または組み合わせてマウスを前処理し、続いてチルゼパチドおよび腹腔内耐糖能試験（IPGTT）を実施しました（図1b）。 両方のインクレチン受容体での活性の機会を提供するために、野生型マウスにおける血糖降下のための最大用量として特定された 3 nmol kg-1 のチルゼパチドを使用しました (拡張データ図 1b)。 グルコース投与前、チルゼパチドは空腹時血糖を減少させたが、これはGLP-1Rの拮抗作用によって予防されたが、GIPRによっては予防されなかった(図1c)。 チルゼパチドは、IPGTT中の血糖を強力に低下させましたが、この効果はGLP-1R拮抗作用によって完全にブロックされました（図1d）、または実験がGlp1rノックアウトマウスで行われた場合（拡張データ図1c）。 比較すると、GIPRの拮抗作用は、血糖を低下させる3 nmol kg-1のチルゼパタイドの作用を変えず、耐糖能に対するGLP-1Rアンタゴニストの効果にも影響を与えませんでした（図1d）。 高用量のチルゼパチドは GIPR5 で活性を示すことが実証されており、30 nmol kg-1 のチルゼパチドを使用してこれらの実験を繰り返すことになりました。 我々は、GLP-1R拮抗作用がチルゼパチドの血糖降下効果を部分的にしか遮断しないことを発見した（拡張データ図1c）。 さらに、GIPR拮抗作用だけではこの高用量のチルゼパチドの効果を防​​ぐことができなかったが、両方の拮抗薬の複合効果が見られ、チルゼパチドに反応した血糖値の低下を防ぐことができた。 これらのデータは、チルゼパチドが mGIPR に関与できるが、マウスでそうするには高用量が必要であることを示す以前の結果と一致します。

a、対照マウスおよびGiprのβ細胞特異的欠失を有するマウス（Gipr-β細胞-/-）のマウス膵島を、Ex9の有無にかかわらず、傾斜濃度のチルゼパチド（TZP）（0〜100 nM）で灌流しました。分２８から始まる１μＭ濃度。ベースラインとして４２分の値を使用して、ＴＺＰのｉＡＵＣを計算した。 すべてのグループで n = 5。 b、Ex9、GIPRアンタゴニスト（GIPR ant）、または両方の組み合わせの存在下で、マウス膵島を漸増濃度のTZP（0〜100 nM）で灌流しました。 すべてのアンタゴニストは、28 分から開始して 1 μM 濃度で使用しました。ベースラインとして 42 分の値を使用して、TZP の iAUC を計算しました。 PBS および GIPR アリ、n = 4。 Ex9 および Ex9 + GIPR ant、n = 5。c、グルコース投与直前の 5 時間の絶食後の血糖。 アンタゴニストは2時間前に投与し、TZPは1時間前に投与した。 すべてのグループで n = 8。 d、IPGTT中の血糖。 iAUC は空腹時血糖値を使用して計算されました。 PBS、TZP および TZP + GIPR アリ、n = 8; TZP + GLP-1R ant および TZP + GLP-1R/GIPR ant、n = 7。すべての値は平均値 ± sem です。統計検定は、Tukey の事後検定を使用した二元配置分散分析 (a) および Tukey の事後検定を使用した一元配置 ANOVA でした。 -hoc テスト (b–d)。

ソースデータ

チルゼパチドは、マウスインクレチン受容体において GIPR よりも GLP-1R を優先しますが、ヒトインクレチン受容体における相対的な効力については逆のことが報告されており、チルゼパチドの活性は GIPR に向かって傾いています 5,16。 私たちのマウス研究は、チルゼパチドが主に GLP-1R を介してインスリン分泌を刺激することを示唆していますが、受容体薬理学における種の違いにより、この解釈のヒトへの拡張は制限される可能性があります 25,26。 したがって、我々は次に、ヒトドナーから単離された島におけるインスリン分泌を刺激するためにどのインクレチン受容体チルゼパチドを使用するかを決定した。 以前に公表された濃度と一致させるために、30 nM のチルゼパチドを使用しました5。 単一の代表的なドナーからの実験では、GLP-1Rに拮抗してもチルゼパチド刺激によるインスリン分泌は減少しませんでしたが、GIPRに拮抗するとインスリン分泌が約55％減少しました（図2a）。 ヒトサンプルに関連するドナー間のばらつきのため、我々は、BMI、年齢、HbA1C%の範囲にわたる、男女のドナーを含む追加のヒト膵島セットでこのプロトコルを繰り返しました（拡張データ表2）。 これらの研究では、GLP-1R拮抗作用の効果は膵島調製物によって異なり、実験のほぼ半数でチルゼパチド刺激インスリン分泌を減少させることができませんでしたが（図2b）、一方、GIPR拮抗作用はすべての実験において一貫してチルゼパタイド刺激インスリン分泌を減少させました。ドナーセット（図2b）。 すべての膵島調製物を平均し、対照条件と比較した減少率として表すと、GLP-1R拮抗作用だけではインスリン分泌は有意に減少しなかったが、これはおそらく、様々なドナー間のばらつきが大きいためである(図2c)。 しかし、GIPR拮抗作用のみでは、PBSおよびGLP-1R拮抗作用の両方と比較して、チルゼパチド刺激性インスリン分泌が減少した。 最後に、2 つのアンタゴニストを追加しても、GIPR アンタゴニスト単独の場合と異なる効果は生じませんでした。 同様の結果は、以前に特徴付けられている別の GIPR アンタゴニストである hGIP(3-30) (拡張データ図 2) を使用した場合にも見られました 27。 これらの研究から、我々は、チルゼパタイドのインスリン分泌促進効果は両方の受容体によって媒介されるが、各受容体の寄与はドナーによって異なると結論付けました。 利用可能なドナーの特徴やグルコース刺激によるインスリン分泌速度との相関はありませんでした。 さらに、GIPRに拮抗すると、各膵島セットにおけるチルゼパタイド刺激のインスリン分泌が減少し、単離されたヒト膵島におけるチルゼパタイドのインスリン分泌刺激にはGIPRでの活性が必要であることが実証された。

a、1セットのヒト膵島からの膵島灌流。 Ex9 (1 μM)、GIPR アンタゴニスト (GIPR ant)、またはその両方の存在下で、30 nM チルゼパチドに応答してインスリン分泌を測定しました。 グループごとに n = 3。 b、ヒト膵島の8つの個別のセットにおけるチルゼパチドに応答したインスリン分泌のiAUC値。 破線は、チルゼパチド刺激前のグルコース刺激によるインスリン分泌のレベルを示します。 グループごとに n = 3。 c、ヒト島における8つの実験すべての要約データ。 個々の実験を平均して各条件の単一のデータ ポイントを生成し、対照条件に対する相対値として表しました。 個々の実験には接続線があります。 n = 8。すべての値は平均値 ± 標準誤差です。統計検定は、Tukey の事後検定を使用した一元配置分散分析でした (b、c)。

ソースデータ

次に、我々は、各受容体におけるチルゼパチドの相対的な寄与を評価するための直交的なアプローチとして、アルファ細胞からのグルカゴン分泌に対する膵島インクレチン受容体の既知の作用を利用した。 GLP-1R アゴニズムは、単離されたヒト膵島 28 と生体内 29 の両方でグルカゴン分泌を減少させる十分に確立された作用を持っていますが、GIPR アゴニズムは前臨床モデル 11 およびヒトにおけるグルカゴン分泌を増加させます 30。 興味深いことに、グルカゴン分泌に対する GLP-1 と GIP の組み合わせは、グルカゴン分泌を相殺する 31,32,33 か、またはグルカゴンレベルを低下させる 34 と報告されています。 両方のインクレチン受容体アゴニストの複合作用がグルカゴン分泌を減少させることを示す研究は、GLP-1R アゴニズムの阻害作用が GIPR アゴニズムの刺激作用を上回ることを示唆しています。 単離されたヒト膵島では、hGIPがグルカゴン分泌を刺激し、GLP-1がグルカゴン分泌を減少させ、2つのペプチドの組み合わせが相互に相殺して、非刺激レベルと一致するグルカゴン分泌速度を生み出すことを確認しました（図3a）。 さらに、我々は、ヒト膵島の単一ドナーセットにおける等モル濃度のhGIPと比較して、チルゼパチドがグルカゴン分泌の同様の増加を引き起こすことを発見した（図3b）。 興味深いことに、その後のhGIPとチルゼパタイドの両方による刺激はグルカゴン分泌に対する影響を減少させ、ある程度の脱感作を示唆しましたが、チルゼパタイドのみが有意な効果をもたらしました（図3b）。 さらに、本発明者らは、ＧＬＰ－１Ｒではなく、ＧＩＰＲの拮抗作用が、ｈＧＩＰまたはチルゼパチドのいずれかのグルカゴン分泌を刺激する能力を完全に遮断することを証明することができた（拡張データ図３）。 注目すべきことに、ヒト膵島の異なるドナーセットにわたってグルカゴン分泌が一貫していた。 グルカゴン分泌の大きさはドナーによって異なりましたが、すべての膵島セットでチルゼパチドはグルカゴン分泌を一貫して増加させました（図3c）。 この発見は、GLP-1Rアゴニズムによって生じる阻害作用を上回るα細胞GIPRにおけるチルゼパチドの強力な活性を実証し、チルゼパタイドがヒト膵島のGIPRにおいて重要な活性を有するというさらなる証拠を提供する。 我々は以前、α細胞におけるGIPR活性がマウス膵島におけるアミノ酸刺激性グルカゴン分泌を増強することを示した11。そして今回、食後の状態で見出されるアミノ酸濃度を使用して、ヒト膵島におけるhGIPとアミノ酸との間の同様の相互作用を発見した（拡張データ図） 4)11、これにより、ヒト膵島における GIPR のチルゼパチド結合もグルカゴン分泌に対するアミノ酸の効果を増強するかどうかという疑問が生じました。 興味深いことに、グルカゴン分泌に対するチルゼパタイドの効果はグルコース濃度やアミノ酸の存在とは無関係であることがわかり（図3d）、α細胞におけるhGIPとは異なるメカニズムが示唆されています。 最後に、チルゼパチドがソマトスタチン分泌を一貫して増加させることを発見しました（図3e）。これは、GIPRとGLP-1Rの両方の活性と一致するα細胞との関与を示唆しています35,36。 我々の研究を総合すると、チルゼパチドは 3 つの主要な膵島ホルモンすべてを増加させ、ヒト膵島の両方のインクレチン受容体で機能活性を示すことが示されています。

a、16 mM グルコース条件下で 30 nM hGIP または GLP-1 で個別に (8 ～ 24 分)、または一緒に (32 ～ 50 分) 刺激されたヒト膵島からのグルカゴン分泌。 iAUC は、最初の時点の値をベースラインとして使用して、ペプチドの個別の効果 (8 ～ 24 分) および複合効果 (32 ～ 50 分) に対して計算されました。 GIP、n = 4; GLP-1、n = 6; GIP + GLP-1、n = 10。b、16 mM グルコース条件下で 30 nM の hGIP またはチルゼパチド (TZP) で処理したヒト膵島からのグルカゴン分泌。 iAUC は、それぞれ 1 回目と 2 回目の刺激のベースライン値として 24 分目と 54 分目を使用して計算されました。 すべてのグループで n = 3。 c、16 mM グルコース条件下でのヒト膵島の 8 つの個々のドナー セットにおける 30 nM TZP に応答したグルカゴン分泌。 これらの実験の概要は、55 ～ 65 分の平均値として示されています。 右の y 軸の誘導倍数は、35 ～ 45 分のベースライン グルカゴン値を使用して計算されました。 各ドナーの場合は n = 3、要約データの場合は n = 8。 d、3 mM アラニンの有無にかかわらず、2.7 mM グルコース (2.7 G) または 10 mM グルコース (10 G) のいずれかで TZP (30 nM) で刺激されたヒト膵島 (ドナー R464) におけるグルカゴン分泌。 n = 3。e、ベースラインサンプルまたはTZP刺激中に採取されたプールサンプルからのソマトスタチン濃度。 n = 3。すべての値は平均±標準誤差です。統計検定は、Tukey の事後検定を使用した一元配置分散分析 (a)、Sidak の事後検定を使用した二元配置分散分析 (b)、対応のある t 検定 (c、d) でした。および対応のない t 検定 (e)。

ソースデータ

要約すると、これらの結果は、チルゼパチド薬理の理解においていくつかの重要な進歩をもたらします。 第一に、ヒト膵島におけるチルゼパタイドのインスリン分泌促進作用は、GIPR 活性に依存しています。 これは、チルゼパチドが単により強力な GLP-1R アゴニストであるかどうか、また GIPR の活性化が代謝結果に寄与するかどうかという問題に直接対処します。 初代ヒト膵島におけるインスリン分泌を読み取り値として使用することは、チルゼパタイドの血糖効果と密接に関連するシステムにおいてこの疑問を調べるためのプラットフォームを提供します。 この一連の研究は、糖尿病の有無にかかわらずヒトを対象とした in vivo 研究で行うのが最適ですが、薬物動態が拡張されているため、β 細胞機能に向けたチルゼパチドを用いた急性研究の計画は困難となっています。 実際、T2D29 患者には GIP のインスリン分泌作用が存在しないという考えにより、高血糖の治療法としての GIPR アゴニストの開発は停滞しています。 しかし、新たな証拠により、この考えは再考する必要があります。 まず、最近の研究では、GIPR 拮抗作用により、T2D 患者の食事耐性試験中のインスリン分泌が減少することが示されました 37,38。 この観察は、内因性GIPが2型糖尿病においても必須であることを強調しており、GIPRを標的とする薬剤の可能性を示唆している。 第二に、2型糖尿病患者における4週間の効果的なグルコース低下は、GIPおよびGLP-1のインスリン分泌促進作用を増強する(参考文献39、40)。 したがって、GLP-1RおよびGIPRにおけるチルゼパチドの相対活性は、糖尿病の有無や高血糖の程度によって異なる可能性があります。 実際、我々のデータは、非糖尿病ドナーからの膵島全体であっても、チルゼパチドのインスリン分泌促進作用に対するGLP-1R対GIPRの相対的な寄与が異なることを示している。 健康な被験者における GLP-1 に対するベータ細胞の感受性は最大 10 倍も変化するという観察結果を考慮すると、これは驚くべきことではありません 41。 したがって、モノアゴニストである GLP-1RA と比較して、血糖コントロールに対するチルゼパチドの有効性が増加していることの 1 つの潜在的な説明は、両方のインクレチン受容体を標的とすることで、GLP-1 に対して比較的非感受性の被験者であってもある程度のインスリン分泌活性が維持されるということです。 これらの仮説を検証することは、ベータ細胞機能に対する GIPR アゴニズムの肯定的な特性を示した以前の文献の再検討と同様に、今後の努力に値する 10,42,43。

2 番目の重要な観察は、チルゼパチドの mGIPR における活性が mGIP に比べて弱いことです。 私たちの研究では、GIPR の拮抗は、マウスの血糖降下における最大値である 3 nmol kg-1 の用量での IPGTT 中のチルゼパタイド刺激インスリン分泌や血糖コントロールに影響を与えませんでした。 しかし、受容体薬理学に関する我々のデータと一致して、用量を我々の研究の最大用量の10倍である30 nmol kg-1に増加すると、チルゼパチドがGlp1r-/-マウスまたはGLPの存在下でインスリン分泌促進活性を有することが示された。 -1R アンタゴニスト 5。これは、チルゼパチドが十分に高い濃度でマウス ベータ細胞の GIPR に関与できることを示しています。 さらに、チルゼパチドは、GIPR モノアゴニズムによって表現模倣される形で Glp1r-/- マウスのインスリン感受性を高め 14、mGIPR におけるチルゼパタイドの活性を裏付けています。 したがって、問題はチルゼパチドが mGIPR を活性化できるかどうかではなく、むしろ活性化するためにどのくらいの用量のチルゼパチドが必要かということです。 重要な考慮事項の 1 つは、インクレチン受容体の発現パターンがチルゼパチドに対する用量反応関係を決定する可能性があるということです。 両方のインクレチン受容体を発現するベータ細胞では、チルゼパタイドは GLP-1R でより強力であり、より低い用量で GIPR での活性が制限されます。 より高用量のチルゼパチドは、mGIPRの関与を可能にする可能性があるが、これらの高用量がGLP-1R:GIPR活性の比の影響を変えるかどうかは依然として不明であり、結果の解釈を混乱させる可能性がある。 逆に、1 つの受容体のみを発現する細胞タイプ (GIPR のみを生成する脂肪組織など) または特定の神経細胞集団は、高用量のチルゼパチドによる影響が少ない可能性があります。 全体として、マウスにおける我々の結果は、チルゼパチドの研究にマウスモデルを使用することの限界を浮き彫りにしており、この種におけるデータの慎重な実験計画と解釈が必要である。

これらの研究からの最後の重要な結論は、チルゼパチドによって誘導されるグルカゴン分泌の強力な増加である。 この発見は、膵島における GIPR 活性がグルカゴン分泌を刺激することを実証する一連の文献と一致します 11。 チルゼパチドが単離された島におけるグルカゴン分泌を増加させるという我々の発見は、GIPRにおける意味のある活性を実証するだけでなく、チルゼパチドがヒト島におけるグルカゴン分泌に対するGLP-1Rにおける活性を克服できるという証拠も提供する。 私たちの研究では、グルカゴン分泌に対するチルゼパタイドの効果を直接評価していますが、チルゼパタイドを用いた臨床試験では、空腹時グルカゴンと混合食チャレンジによるグルカゴン反応の両方の減少が報告されています17。 これらのデータは、チルゼパタイドがアルファ細胞の活性を刺激するという我々の観察と矛盾しているように見えるが、チルゼパタイド群の被験者の代謝プロファイルが28週間の間に劇的に改善し、解釈が複雑になったことに留意することが重要である。 実際、代謝ストレスの増加により、代償的にα細胞とβ細胞の両方の活性が上昇し、空腹時および刺激時のインスリンおよびグルカゴンレベルの両方が上昇します。 逆に、体重の減少と血糖コントロールの改善は、アルファ細胞とベータ細胞の両方の代償活性を低下させ、インスリンとグルカゴンのレベルを低下させます。 例えば、チルゼパチドで治療された被験者は、空腹時および刺激されたインスリンレベルの低下も示しましたが、データはチルゼパチドがインスリン分泌を阻害するという結論には至っていません。 チルゼパチド刺激によるグルカゴン分泌の影響についてはさらなる研究が必要ですが、グルカゴン作動性の潜在的な代謝上の利点を中心とした新しい仮説が示唆されています。 GLP-1R、GIPR、GCGRのトリアゴニストなど、グルカゴン受容体アゴニズムを組み込んだ次世代のマルチ受容体アゴニストが減量と血糖コントロールに多大な期待を示しているため、これは特に興味深い。

単離されたヒト島における我々の研究は、β細胞とα細胞の両方において、GIPRにおけるチルゼパチドの強力な作用を明らかに示している。 私たちが使用したヒト膵島は、幅広い代謝特性を持つドナーからのものでしたが、2 型糖尿病のドナーからの膵島を含める機会がなかったことに注意することが重要です。 さらに、単離された膵島は、全身生理学に存在する調節の全範囲を組み込んでいない閉鎖系を提供し、血流量や遊離ペプチド濃度などの追加の詳細を正確に再現できない可能性があり、このモデルの限界の一部を浮き彫りにしています。 したがって、インクレチン受容体の強力な阻害剤を使用して、これらの研究をヒト被験者にも拡張することが重要です。 しかし、ここで示したデータは、単離されたヒト島において、チルゼパチドがインスリンとグルカゴンの両方の分泌を刺激するために GIPR を必要とすることを明確に示しています。

HEK293T 細胞を 5% CO2、37 °C で維持し、10% 熱不活化ウシ胎児血清 (FBS、カタログ番号 10500064; Life Technologies) を添加した DMEM (カタログ番号 11995073; Life Technologies) で培養しました。100 IU ml-1 のペニシリン、および 100 μg ml-1 のストレプトマイシン溶液 (ペニシリン-ストレプトマイシン、カタログ番号 P4333; Sigma-Aldrich)。 まだ対数増殖期にある間に、HEK293T 細胞 (ウェルあたり 700,000) を DMEM (10% FBS、1% ペニシリン-ストレプトマイシン) 中の 6 ウェル プレート (カタログ番号 10234832; Fisher Scientific GmbH) に播種しました。 70%コンフルエントに達してから24時間後、リポフェクタミン2000(カタログ番号11668019; Invitrogen)を製造業者のプロトコールに従って使用して、一過性トランスフェクションを実施した。 トランスフェクションの 24 時間後、HEK293T 細胞を PBS で洗浄し、5% FBS および 2 mM の L-グルタミン (カタログ番号 25030081) を含む FluoroBrite フェノールレッド不含完全培地 (カタログ番号 A1896701; Life Technologies) に再懸濁しました。 ;ギブコ）。 次に、ウェルあたり 100,000 個の細胞をポリ-D-リジンでコーティングした (カタログ番号 P6403; Sigma-Aldrich) 96 ウェル白色ポリスチレン LumiNunc プレート (カタログ番号 10072151; Fisher Scientific) にプレーティングしました。 24 時間後、培地を、10 μM のセレンテラジン-h (カタログ番号 S2011; Promega) または 1:500 希釈の NanoGlo (カタログ番号 N1110; Promega) を含む HBSS (カタログ番号 14025092; Gibco) に交換しました。 ）。 BRET 測定は、PHERAstar FS マルチモード マイクロプレート リーダーを使用して 1 分ごとに行われました。 ベースライン測定は、セレンテラジン h または NanoGlo 含有 HBSS との最初の 5 分間のインキュベーション後に取得し、その後細胞をビヒクル (PBS) またはそれぞれのリガンドのいずれかで処理しました。 リガンド特異的なレシオメトリック BRET シグナルをビヒクルに対して正規化し、「リガンド誘導 BRET 比」46 を生成し、その後、十分に特異的なベースライン読み取り値にさらに正規化しました。 時間スケールでのリガンド誘発測定は、時点ゼロ後のその後の測定として表されます。 正または負の曲線下の増分面積 (+iAUC、-iAUC) は、記載されている場合に計算されました。 濃度応答曲線は、Prism 9.0 の 3 パラメーター ロジスティック フィッティングによって生成されました。

クローン化されたヒトおよびマウスの GLP-1R および GIPR を発現する HEK 細胞からの膜は、以前に記載されているように調製されました 47。 ヨウ素化GLP-1およびGIP放射性リガンドの同族受容体への置換を定量するための競合結合法を、参考文献に記載されているように実施した。 図１６に以下の変更を加えたものである。 アッセイ緩​​衝液は、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４中の２．５ｍＭ ＭｇＣｌ ２ 、１．０ｍＭ ＣａＣｌ ２ 、０．００３％ｗ／ｖ Ｔｗｅｅｎ ２０、０．１％ ｗ／ｖバシトラシン（ＵＳＢ ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）から構成された。 約 0.05 nM の放射性リガンド (ヒト/マウス [125I]GLP-1(7-36)NH2 およびヒト [125I]GIP(1-42)OH、両方とも PerkinElmer >2,200 Ci mmol-1、>95% 純度) を添加しました。 96 ウェルプレート (カタログ番号 3632; Corning) 内の 100 μl アッセイバッファー中のペプチド (DMSO 中の濃度 - 反応曲線、最終濃度 0.96%)。 WGA-PVT SPAビーズ(PerkinElmer)とともに室温で2時間プレインキュベートした膜を含むアッセイ緩​​衝液(100μl)を加えた。 メンブレンおよびビーズの量は次のとおりでした: hGLP-1R (0.35 μg タンパク質、0.125 mg ビーズ)、mGLP-1R (0.25 μg タンパク質、0.125 mg ビーズ)、hGIPR (6 μg タンパク質、0.2 mg ビーズ) および mGIPR (7 μg タンパク質) 、０．２５ｍｇビーズ）。 プレートをシーリングテープ (Perkin Elmer) で覆い、混合して室温で 14 ～ 16 時間インキュベートしました。 プレートを２００×ｇで５分間遠心分離し、シンチレーションカウンター（ＭｉｃｒｏＢｅｔａ Ｔｒｉｌｕｘ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用して結合放射能を定量した。 総結合量は、競合物質の非存在下で結合した放射性リガンドの量であった。 非特異的結合は、100 nM の GLP-1(7-36) またはヒトまたはマウスの GIP(1-42)NH2 によって定義されました。 放射性リガンドの Bmax 値は、相同競合を使用して計算されました。 競合ペプチドの IC50 値は PRISM 7 (GraphPad) を使用して計算され、Ki 値は Cheng-Prusoff 補正を使用して計算されました 48。

これらのアッセイの方法は以前に説明されています16。 簡単に言うと、GTPγS 結合に関して、GTPγS 結合 Gαs サブユニットの受容体依存性上昇を刺激するリガンドの効力を、低受容体密度の受容体クローン細胞株からの膜調製物を使用して測定しました。 反応物を白色透明底マイクロタイタープレート中で室温で30分間インキュベートし、対照ウェルを基準として使用して最大反応のパーセントを計算した。 相対ＥＣ５０値は、パーセント応答対リガンド濃度を使用する非線形回帰分析によって導出され、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ７ソフトウェアを使用して４パラメータロジスティック方程式に当てはめられた。 cAMP アッセイでは、Glosensor 22 F ベクター (Promega) をトランスフェクトした低密度受容体細胞クローンで動態 cAMP アッセイを実施しました。 細胞を5〜20分間平衡化し、その後20μlの10×リガンドを添加し、発光の時間経過を収集した。 リガンド (10x) を、DMSO で手動で段階希釈し、続いてアッセイバッファーにステップダウンすることによって滴定しました。

一般的な灌流プロトコルの詳細は以前に説明されています11。 簡単に言うと、数とサイズの両方に関してチャンバー間で一貫性を確保するために、島を個別に選択しました。 合計 75 個の膵島を個々のチャンバーにロードし、2.7 mM グルコース Krebs-Ringer-phosphate-HEPES (KRPH) 緩衝液 (140 mM NaCl、4.7 mM KCl、1.5 mM CaCl2、 1 mM NaH2PO4、1 mM MgSO4、2 mM NaHCO3、5 mM HEPES および 0.1% FA フリー BSA (pH 7.4)) と 100 μl の Bio-Gel P-4 培地 (Bio-Rad)。 流量は、この装置に対するメーカーの提案に基づいています。 グルコース濃度の変化は、図および図の凡例に示されています。 アンタゴニストは、完全なアンタゴニズムを提供するために事前に確立された 1 μM 濃度で使用しました。 チルゼパチドの濃度を 0 ～ 100 nM まで変化させました。 インスリン濃度は、速度と膵島数の両方の関数として表されます (ng ml-1 × (1/200 μl ml-1) × (1/75 膵島))。 チルゼパチドの iAUC は、各サンプルのベースラインとして 42 分の値を使用して、42 ～ 80 分で計算され、時間の関数として表されます (ng/(膵島 × 分) × 分)。 インスリン値は、EnVisionプレートリーダー(PerkinElmer)を使用するLumitインスリンイムノアッセイ(Promega)により測定した。

ヒト膵島は、Alberta Diabetes Institute と Integrated Islet Distribution Program の両方から入手しました。 すべての島は同意したドナーから入手しました。 一般的な灌流プロトコルの詳細は以前に説明されており 21 、マウスの灌流プロトコルと同様です。 インスリン分泌実験 (図 2) では、各サンプルのベースラインとして 42 分の値を使用して、チルゼパチドの iAUC を 42 ～ 65 分で計算しました。 ヒト膵島の各セットは、各条件ごとに n = 3 で構成されました。 これらを平均して単一のデータポイントを生成しました (図 2c)。 インスリン値は、EnVisionプレートリーダー(PerkinElmer)を使用するLumitインスリンイムノアッセイ(Promega)により測定した。 グルカゴン分泌実験 (図 3) では、対照条件 (35 ～ 45 分) および刺激条件 (55 ～ 65 分) で平均グルカゴン値が計算されました。 以前の研究に基づいて、すべてのペプチドを 30 nM 濃度で使用しました 16。 アミノ酸は、以前の研究に基づいて 3 mM の濃度で使用されました 11。 グルカゴンは、EnVision プレートリーダー (PerkinElmer) を使用して、Lumit Glucagon Immunoassay Kit (カタログ番号 CS3037A02; Promega) で測定しました。 ソマトスタチンは、ELISA アッセイ (カタログ番号 FEK-060-14; Phoenix Pharmaceuticals) で測定しました。 すべてのデータは、流速と膵島数の両方に対する測定濃度として表されます（インスリン、ng ml-1 × (1/200 μl ml-1) × (1/75 膵島)、グルカゴン、pM × (1/200 μl) ml-1) × (1/75 膵島); ソマトスタチン、pg ml-1 × (1/200 μl ml-1) × (1/75 膵島))49。 ヒト膵島および膵臓組織は、アルバータ大学のヒト研究倫理委員会 (Pro00013094、Pro00001754) の倫理的承認の下、死亡したドナーから単離され、NIDDK が資金提供する統合膵島分布プログラム (IIDP) (RRID: SCR _014387) から取得されました。 。 すべてのドナーの家族は、研究における膵臓組織の使用についてインフォームドコンセントを与えたが、金銭的な補償は受けなかった。

動物を 5 時間絶食させた後、1.5 g kg-1 グルコースを腹腔内投与しました。 特異的アンタゴニストはグルコースの 2 時間前に 1,500 nmol kg-1 の用量で投与され、チルゼパチドはグルコースの 1 時間前に投与され、すべて腹腔内注射によって行われました。 グルコースは手持ち式グルコメーター(Contour Blue、Bayer)を用いて測定した。 空腹時血糖は、グルコース投与後0、1時間で測定した。 AUCは、各動物の空腹時血糖値を使用して計算されました。 すべての野生型マウスは、Jackson Laboratories (カタログ番号 000664) から 8 ～ 12 週齢で購入しました。 すべてのベータ細胞 Gipr ノックアウト マウスは、前述のように社内で飼育されました 10。 すべてのマウス手順は、デューク大学施設内動物管理使用委員会に従って承認され、実行されました。

ここに記載されているすべての試薬は、責任著者への合理的な要求に応じて配布できます。

マウスおよび細胞実験のサンプルサイズは、同様の実験プロトコルで以前に生成されたデータを使用した検出力計算に基づいています。 ヒト島実験は、機器の能力と実験デザインに基づいて実施されました。 適切な統計検定が実行され、個々の実験ごとに以下のグラフに示されています。 ANOVA では、特定の違いを特定するために Tukey 事後分析が実行されました。 すべての統計検定では、統計的に異なる値を識別するために 0.05 未満の P 値が使用されました。 特定の統計検定は拡張データ表 3 に示されており、結果は補足の生データ ファイルの各データ パネルで利用できます。 表示されているすべての値は平均値 ± 標準誤差です。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Portfolio Reporting Summary を参照してください。

すべての生データはジャーナルに提供されており、責任著者への合理的な要求に応じて利用可能です。 ソースデータはこのペーパーに付属しています。

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リファレンスをダウンロードする

KE は、NIH NIDDK (K01 DK132461) からの資金提供によって支援されました。 MT は、欧州研究評議会 (ERC)-AdG HypoFlam 助成金 (695054) からの資金提供によって支援されました。 TDM は、ドイツ研究財団 (DFG TRR296、TRR152、SFB1123 および GRK 2816/1)、ドイツ糖尿病研究センター (DZD eV)、および ERC-CoG (101044445) からの資金提供によってこの研究を支援されました。 JEC は、NIH NIDDK (R01 DK123075、DK125353 および DK046492)、Helmsley Charitable Trust Foundation、Eli Lilly、Novo Nordisk、Proteostasis からの研究者主導の助成金による資金援助を受けており、ボーデン奨学生でもあります。 技術支援をしていただいた C. Stutsman 氏と C. Corkins 氏に感謝します。 また、プロジェクトへの支援と原稿に関する有益な議論をしていただいた R. Samms、J. Moyers、M. Coghlan、R. Gimeno にも感謝します。 最後に、ヒト膵島を使用できるドナーに感謝し、このリソースを提供してくれたアルバータ糖尿病研究所膵島コアおよび統合膵島分布プログラム (IIDP) の P. MacDonald に感謝します。

ヘルムホルツ ツェントラム ミュンヘン - ドイツ健康環境研究センター (GmbH) によって提供されるオープンアクセスの資金。

これらの著者は同様に貢献しました: Kimberley El、Jonathan D. Douros。

デューク分子生理学研究所、米国ノースカロライナ州ダーラム

キンバリー・エル、アショット・サルグシアン、アレックス・チェン、ドナルド・ウォース、デヴィッド・A・ダレッシオ、ジョナサン・E・キャンベル

ノボ ノルディック研究センター、米国インディアナ州インディアナポリス

ジョナサン・D・ドゥロス、ビン・ヤン、ブライアン・フィナン

リリー研究所、イーライリリーアンドカンパニー、米国インディアナ州インディアナポリス

フランシス・S・ウィラード、デヴィッド・B・ウェインスコット、カイル・W・スループ

糖尿病・肥満研究所、ヘルムホルツ・ツェントルム・ミュンヘン、ノイヘルベルク、ドイツ

アーロン・ノヴィコフ、カラム・クープランド、ティモ・D・ミュラー

ドイツ糖尿病研究センター (DZD)、ノイヘルベルク、ドイツ

アーロン・ノヴィコフ、カラム・クープランド、ティモ・D・ミュラー

シンシナティ大学医学部内科、米国オハイオ州シンシナティ

ディエゴ・ペレス＝ティルベ

ヘルムホルツ ツェントゥム ミュンヘン、ノイヘルベルク、ドイツ

マティアス・H・チョップ

ミュンヘン工科大学、ミュンヘン、ドイツ

マティアス・H・チョップ

米国ノースカロライナ州ダーラムのデューク大学医学部内分泌科

デヴィッド・A・ダレッシオ & ジョナサン・E・キャンベル

米国ノースカロライナ州ダーラムのデューク大学薬理学および癌生物学部

ジョナサン・E・キャンベル

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JDD、TDM、KWS、JEC がこの研究を発案しました。 KE、FSW、AN、AS、DPT、DBW、BY、AC、DW、CC が調査を実施しました。 FWS、JDD、AN、TDM、FWS、JEC が分析と解釈を実施しました。 JDD、DAD'A.、TDM、KWS、および JEC が原案を作成しました。 著者全員が最終原稿を確認、編集し、承認しました。 JDD、MHT、BF、DAD'A.、KWS、TDM、JEC が資金調達と運営に貢献しました。 JEC は、この原稿に記載されているデータについて一次責任を負います。

カイル・W・スループ、ティモ・D・ミュラー、ジョナサン・E・キャンベルとの通信。

キャンベル グループは、ノボ ノルディスクとイーライ リリーから基礎科学への資金提供を受けています。 ミュラー グループは、ノボ ノルディスクから基礎科学への資金提供を受けています。 FSW、DBW、KWS はイーライリリーの従業員です。 JDD、BY、BF はノボ ノルディスクの従業員です。 DAD は、過去 12 か月間、Eli Lilly および Structure Therapeutics でコンサルタントまたは講演者を務めてきました。 JEC は、過去 12 か月以内に構造療法学のコンサルタントまたは講演者を務めてきました。 残りの著者は、競合する利益や利益相反を宣言していません。

Nature Metabolism は、この研究の査読に貢献してくれた Nigel Irwin と Stefan Offermanns に感謝します。 主な担当編集者: Christoph Schmitt、Nature Metabolism チームと協力。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

A) 野生型 (WT) マウスにおける腹腔内ブドウ糖負荷試験 (IPGTT)。 マウスを、グルコースの２時間前にＰＢＳまたはＧＩＰＲアンタゴニストで、グルコースの１時間前にＰＢＳまたはアシル−ＧＩＰ（３または１０ｎｍｏｌ／ｋｇ用量）で前処理した。 ５時間の絶食後にグルコースを１．５ｍｇ／ｋｇで与えた。 積分曲線下面積 (iAUC) は、PBS/GIPR アンタゴニスト投与の直前の血糖測定値を使用して計算されました。 3 nmol/kg 用量: PBS/PBS、n = 7; PBS/アシル-GIP、n = 6、GIPR Antag/アシル-GIP、n = 6。10 nmol/kg 用量: PBS/PBS、n = 7。 PBS/アシル-GIP、n = 8、GIPR Antag/アシル-GIP、n = 7。B) WT マウスの IPGTT 中のチルゼパチドの用量反応曲線。 (n = 5/グループ) B) WT および Glp1r ノックアウト マウスにおける IPGTT 中のチルゼパチド。 (n = 8/グループ) C) GLP-1R (Jant-4)、GIPR、またはその両方のアンタゴニストで処置された WT マウスにおける 30 nmol/kg チルゼパチド。 N = 8/グループ。 すべての値は平均値 + /- SEM です。 次の統計検定が使用されました: A、B、D) Tukey の事後検定を使用した一元配置分散分析、C) Tukey の事後検定を使用した二元配置 ANOVA。

ソースデータ

ヒト膵島の 2 つの独立したドナー セットを、1 μM 濃度のエキセンディン (9-39) (Ex9)、hGIP(3-30) (GIPR Ant)、またはその組み合わせの存在下で 30 nM チルゼパチド (TZP) で刺激しました。 最初の時点の値をベースラインとして使用して、グルコースとチルゼパチド刺激によるインスリン分泌の両方について積分曲線下面積 (iAUC) を計算しました。 すべての値は平均値 + /- SEM、n = 3/グループです。 Tukey の事後検定による一元配置 ANOVA を使用しました。

ソースデータ

ヒト膵島は、GIPR アンタゴニスト (GIPR Ant – 左パネル) または exendin(9-39) (Ex9 – 右) の存在下で、チルゼパチドまたは hGIP のいずれかで刺激されました。 チルゼパチドは 30 nM で使用し、アンタゴニストは 1 μM の濃度で使用しました。 すべての値は平均±SEM、GIPRアンタゴニストについてはn = 3/グループ、Ex9については6/グループである。 Tukey の事後検定を使用した二元配置 ANOVA を使用しました。

ソースデータ

ヒト膵島を、30 nM hGIP または 3 mM アミノ酸 (グルタミン、アルギニン、アラニン、ロイシンの組み合わせ) で個別にまたは組み合わせて処理しました。 すべての値は平均±SEM、n = 3/グループです。 Tukey の事後検定を使用した二元配置 ANOVA を使用しました。

ソースデータ

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転載と許可

El、K.、Douros、JD、Willard、FS 他。 インクレチン コアゴニストであるチルゼパチドは、ヒト膵島からのホルモン分泌に GIPR を必要とします。 ナット・メタブ (2023)。 https://doi.org/10.1038/s42255-023-00811-0

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受信日: 2022 年 11 月 21 日

受理日: 2023 年 4 月 21 日

公開日: 2023 年 6 月 5 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s42255-023-00811-0

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