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May 18, 2023

鳥糞便サンプルからの腐生糸状菌の分離とコクシジウムオーシストに対するその捕食活性の評価

Rapporti scientifici Volume 13,

Scientific Reports volume 13、記事番号: 8965 (2023) この記事を引用

1 オルトメトリック

メトリクスの詳細

動物の胃腸寄生虫の生物的防除に使用される真菌株は、主に牧草地の土壌、腐敗した有機物、草食動物や肉食動物の糞便から分離されています。 しかし、これまでのところ、鳥からのそれらの分離や鳥の消化管寄生虫に対する捕食活動の評価はほとんど行われていない。 この研究は、鳥の糞便サンプルから糸状菌を分離し、コクシジウムに対するその捕食活性を評価することを目的としていました。 2020年7月から2021年4月の間に以前に収集されたニワトリ、産卵鶏、およびクジャクからの58個の糞便サンプルのプールは、水寒天培地および共生培養物を使用して、糸状菌の単離と、コクシジウムオーシストに対するそれらのインビトロ捕食活性の評価に使用されました。 。 オーシストの濃縮懸濁液を得るために、ウィリス浮選法も実施した。 合計 7 つの Mucor 分離株が得られ、同定された唯一の真菌分類群であり、すべてがコクシジウムに対して溶解活性を示しました。 分離株 FR3、QP2、および SJ1 は 70% を超える顕著なコクシジウム抑制効果 (胞子形成の阻害) を示しましたが、分離株 FR1、QP2、および QP1 は 14 日後にそれぞれ 22%、14%、および 8% のコクシジウム抑制効果 (オーシストの破壊) を示しました。数日間の潜伏期間であり、段階的で時間に依存したプロセスです。 私たちの知る限り、これは鳥の糞便からの在来の捕食性真菌の単離と、コクシジウムに対するその溶解活性の実証に関する最初の報告である。

鳥コクシジウム症は、世界中の国内および外来の鳥に影響を与える最も重要な寄生虫病の 1 つであり、養鶏場、鳥類公園、および個人の鳥のコレクションにおいて深刻な健康と経済的懸念の原因となっています 1、2、3、4、5。

この寄生虫症の制御は、主に化学療法（抗コクシジウム剤など）とワクチンによって行われます。 しかし、抗寄生虫薬耐性に関する懸念が高まっているため、鳥類のコレクションにおけるコクシジウム症を制御するための新しい代替または補完的な戦略の開発を目的とした広範な研究が行われてきました。これには、飼料の改善、家の清掃と消毒、さらには不可欠なハーブ抽出物のような天然の解決策が含まれます。油、プロバイオティクスとプレバイオティクス、藻類5、6、7、8、9。 より最近では、ポルトガル、スペイン、ブラジル、デンマークの研究者らは、消化管寄生虫の制御のための駆虫薬の補完として、幼虫駆除および殺卵の特徴を持つ捕食性真菌（「線虫捕食性真菌」または「蠕虫捕食性真菌」としても知られる）の使用を提案している。家禽類および外来鳥類の感染症10．

捕食性真菌を用いた動物の胃腸寄生虫感染症の生物学的防除は、抗寄生虫薬を正確かつ持続的に補完するものであることがすでに証明されており、馬の寄生虫の脱卵（糞便1グラム当たりの卵の数、EPG）の減少において最大97％の有効性を達成しています。および反芻動物11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23。 しかし、他の動物宿主、すなわち鳥、犬、アライグマ、腹膜炎などに影響を与える寄生虫に対する捕食性真菌の性能を評価した in vitro および in vivo 研究はわずかしかありません 10,19,24,25,26,27,28。

捕食性真菌は、その遍在性でも知られており、ほとんどが農地土壌、腐朽有機物、動物の糞便から分離されています29。 アメリカ、ヨーロッパ、アジア、オセアニア、南極大陸で行われた研究では、ヒツジ、ヤギ、ウシなどの多種多様な動物種に属する糞便から、腸内寄生虫よりも前に存在する能力を持つ糸状菌が分離されたことが報告されています30、31、32。 33,34; 水牛35; ロバ34; ハナグマ、アライグマ、ユーラシアオオヤマネコ、ヒグマ、ムフロン、ガゼル、バイソン、ヒトコブラクダ、グアナコ、ワラビー33。 そして馬31,33。 幼虫駆除特性を持つ捕食性真菌の最も一般的に分離された分類群は、Duddingtonia flagrans (Dudd.) RC Cooke (1969)、Arthrobotrys spp.、および Monacrossporium spp. である一方、Pochonia chlamydosporia (Goddard) Zare & W. Gams (2001)、Mucor circinelloides Tiegh (1875)、Purpureocillium lilacinum (Thom) Luangsa-ard、Houbraken、Hywel-Jones & Samson (2011)、Verticillium spp.、および Trichoderma spp. 殺卵特性を示すことが示されている17、29、36。 それにもかかわらず、鳥の糞便サンプルからこれらの真菌を分離する研究は科学文献でまだ報告されていません。

現在の研究は、国内および外来の鳥の糞便サンプルから在来の糸状菌を単離し、コクシジウムのオーシストに対するその in vitro 捕食活性を評価することを目的としていました。

ニワトリ、産卵期、およびクジャクに属する 58 個の糞便のプールから、7 種類の糸状菌を分離することができました。そのうち 3 種類はニワトリから (FR1、FR2、FR3)、4 種類はクジャクから (SJ1 および SJ2) – エキゾチック バード コレクション SJ ; QP1 および QP2 – エキゾチックな鳥のコレクション QP)。

肉眼的および顕微鏡的真菌の特徴付けでは、ほとんどの分離株で同様の結果が明らかになりました。 黄色がかった非分岐の胞子嚢。柱状突起に支えられている。 隔壁のない菌糸。 灰白色でふわふわしたコロニー。 しかし、分離株 QP1 は他の分離株よりも細長い分生子と細長い菌糸を持っていました (図 1、表 1)。 したがって、形態学的評価により、すべての分離株をおそらく Mucor sp. として同定することができました。 他の真菌分類群は同定されなかった。

ムコール分離株の分生子、胞子嚢、および菌糸（FR1-M. circinelloides; FR2-M. circinelloides; FR3-M. circinelloides; SJ1-M. circinelloides; SJ2-M. circinelloides; QP1-M. lusitanicus; QP2-M. circinelloides）。サーシネロイデス; オリジナル)。

ITS1-5.8S-ITS2 配列を Blastn Suite にアップロードすると、各真菌分離株の類似性のトップ 3 を確立できました。FR1 は 2 つの Mucor circinelloides 株 (GenBank アクセッション番号 OW988287 および OW985400) と 99.5% 以上の類似性を示しました。 FR2 は 3 つの M. circinelloides 株 (FN598920、HQ914900、および KJ584557) と 99% 以上の類似性がありました。 FR3 は 2 つの M. circinelloides 株 (MK396486 および KT336541) と 99.8% の類似性がありました。 SJ1 は 3 つの M. circinelloides 株 (KX620480、OW987678、および OW987665) と 100% の類似性を示しました。 SJ2 は 3 つの M. circinelloides 株 (MT991775、NR_126116、および FJ713065) と 99.5% 以上の類似性を示しました。 QP1 は Mucor sp と 99.8% の類似性がありました。 （MK164174）、ムコール・ルシタニクス（OP163597）およびムコール・ラセモサス（MN726736）。 QP2 は 2 つの M. circinelloides 株 (MT603934 および OW988287) と 100% の類似性がありました (表 2)。

Mucor circinelloides CBS 195.68、Mucor lusitanicus CBS 108.17、Mucorracemosus f. の菌株を使用した、すべての分離株の ITS1-5.8S-ITS2 配列の系統解析。 同じくBLAST分析から得られたracemosus CBS 260.68およびMucor fragilisにより、分離株FR1、FR2、FR3、SJ1、SJ2およびQP2をMucor circinelloides rDNA配列として同定することができ、一方、分離株QP1はMucor lusitanicusとして同定された（図2）。

ITS1-5.8S-ITS2 領域に基づく最尤系統樹 (分離株および GenBank 参照株の配列を含む)。 尤度のブートストラップが各ブランチに表示され、50 を超える値のみが考慮されました。 7 つの Mucor 分離株すべてが太字で表示され、その後にそれぞれの GenBank アクセッション番号が続きます。 色付きの四角形は、菌類が得られた鳥のコレクションを表します。青 - ニワトリ。 緑とオレンジ - それぞれエキゾチックなコレクション SJ と QP の孔雀。

in vitro 試験では、すべての分離株が WA 培地 (図 3) と共生培養物 (図 4) の両方でアイメリア オーシストに対して有害な活性を発現したことが明らかになりました。 オーシストの存在が真菌の菌糸の発達とオーシストの被膜への付着を引き起こすことを観察することができました（活性タイプ 1）。 また、真菌に曝露した 30 日間の間に、オーシストの形態が変化し始め、その内部構造はあまり目立たず、空胞が発達しました (タイプ 2)。その後、胞子がオーシスト細胞内で増殖し始め、最終的にその破壊に至りました (タイプ 3)。

WA培地中で、コクシジウムオーシストに対してMucor分離株によって発現した捕食（FR1-M. circinelloides; FR2-M. circinelloides; FR3-M. circinelloides; SJ1-M. circinelloides; SJ2-M. circinelloides; QP1-M. lusitanicus; QP2 —M. circinelloides、オリジナル）。

アイメリア sp. 真菌との共生培養後にさまざまな形態変化を示すオーシスト（A、C、E - オーシストのカプセルの変形、B、D - オーシストの破壊と細胞質内容の喪失、F - 胞子形成オーシスト、オリジナル）。

真菌分離株は、糞便微小環境に曝露された場合（プラスチックカップ試験）、コクシジウム胞子形成の減少とオーシスト構造の損傷という点で、異なる溶解性能を示しました。分離株 FR3、QP2、SJ1、SJ2、および FR2 は、85% という有意な減少効果を示しました（p <オーシストの胞子形成の制限については、それぞれ、FR1、QP2、およびQP1 は、オーシストの破壊に関して、それぞれ 22% (p < 0.001)、14% (p < 0.001)、および 8% (p = 0.01) という有意な減少効果を示しましたが、それは 14 日間の曝露後のみでした。 また、分離株 FR1 (p < 0.001) および QP1 (p = 0.001) に曝露した後、オーシストの生存率が試験の 1 週目と 2 週目で大きく異なるため、殺卵効果は時間依存性でした。 オーシストの生存率はアッセイ中コントロールカップ内で安定しており、1 週間および 2 週間のインキュベーション後、生存率の割合はそれぞれ 97% および 94% に等しく (表 3)、両週の間に統計的な差異は記録されませんでした (p = 0.302)。

捕食性真菌は、動物や植物に影響を与える寄生虫の幼虫、卵、オーシストを捕食して破壊する能力で知られる腐生糸状菌のグループです。 これらの機能的特徴に加えて、それらは他の属性、すなわち、農地土壌、腐朽有機物、動物の糞便などの多種多様な環境サンプルから単離できる可能性があることも知られています。 腸内寄生虫の環境形態も潜んでいることが多い糞便からのそれらの分離は、真菌と寄生虫が糞便と土壌の微小環境で自然に関係を確立し、前者が捕食性真菌の栄養源であることを証明しています17,29,36。 また、健康な動物の糞便からこの種の真菌が分離されたことは、これらの微生物が腸内環境内に存在する平衡状態、したがって免疫正常動物に対して無害であることを示しています17、19、20、28、37、38、39。

私たちの知る限り、この研究は鳥の糞便サンプルから捕食能力を持つ糸状菌を初めて分離することを可能にし、哺乳類、すなわち反芻動物について何人かの著者が以前に報告したように、鳥もこの種の菌類の「自然排出者」であることを示唆している。 、農場や動物園で飼育されている馬や肉食動物30、31、32、33、34、35。

この研究では、腸内寄生虫陽性の鳥の糞便サンプルを使用し、水寒天のような貧弱な培地に最初に接種することで、この培地で増殖できる真菌のグループを制限し、潜在的な捕食性菌のみの増殖を刺激することができました。菌類。 また、WA 培地のほかに、単離ステップでは迅速な菌糸の成長、精製、保存のために小麦粉寒天も使用しました 12。 抗生物質を添加せずにこれら 2 つの培地を使用すると、サブロー寒天、コーンミール寒天、ポテト デキストロース寒天、またはモルト エキス寒天などの他のより栄養価の高い培地と比較して、より迅速かつ経済的なアプローチで、危険な真菌を正確に分離して保存することができます。これらの手順ではクロラムフェニコールが補充されることがよくあります。

糸状菌分離株は、産卵鶏のサンプルからは分離株が得られなかったにもかかわらず、選択されたすべての場所および使用された 2 つの鳥モデル種から得られました。 形態学的分析により、すべての分離株がムコール属に属すると結論付けることができ、分生子、胞子嚢、および菌糸について追跡された定性的および定量的結果は、この属に関する出版された文献と一致していました40,41。 また、rDNA ITS1-5.8S-ITS2 配列に基づく分子評価により、Mucor circinelloides (FR1、FR2、FR3、SJ1、SJ2、QP2) と Mucor lusitanicus (QP1) という 2 つの真菌種が同定され、これらが他の研究で実証されているように、標的配列は捕食性真菌の分子同定に使用するのに実際に適しています 34、42、43、44、45。

すべての真菌分離株は、WA 培地および糞便微小環境内でコクシジウム オーシストに対する溶解活性を発現し、捕食活動のすべての段階を特定することができました。 最初のアッセイに関しては、捕食効率は株間で異なり、FR1 と QP2 がアイメリア種の破壊において最も正確でした。 オーシスト（それぞれ22％と14％の有効性）を示す一方、FR3、QP2、およびSJ1株は70％を超える顕著なコクシジウム抑制効果を示した。 これらの結果は、ポルトガルとスペインの研究者によって行われた以前の研究 27,33 と一致しており、この研究では、さまざまな動物宿主に影響を与える腸内寄生虫の卵およびオーシストに対して M. circinelloides が発現する in vitro 捕食活性が実証されました。 さらに、これは、Mucor spp.の殺コクシジウム活性および静コクシジウム活性を報告する最初の独自の研究論文を構成します。 鳥コクシジウムに対して。 また、今回の研究では、M. ルシタニクスが寄生型に対して開発した捕食スキルが初めて明らかになった。このスキルは、得られた効果よりも低い効力を示したにもかかわらず、14 日間の孵化後のオーシストの生存率に重大な影響を与えた (8%)。他の株については。 ムコール属の能力鳥の腸内寄生虫形態よりも古いものであることは、それぞれ COPAR 研究グループ (獣医学部 – サンティアゴ デ コンポステーラ大学) と LPPD (獣医学部 – リスボン大学) に所属するスペイン人とポルトガル人の著者による研究系統の 1 つです。

14 日間の培養後にのみ真菌の殺虫活性について有意な結果が検出されたこと、および分離株 FR1 および QP1 の 7 日と 14 日のデータ間の有意差により、この種の真菌によって発現される捕食性活性は段階的で時間のかかるものであることが確認されます。 -依存のプロセス。 寄生虫の存在は、それに向かう真菌の菌糸の発達とその莢膜への付着を引き起こす17、27、29、33、36。 寄生虫の卵やオーシストに向かう真菌の菌糸の移動は、捕食プロセスの最も重要な段階の 1 つと考えられます。 菌糸は成長して寄生虫に到達する必要がありますが、このプロセスは糞便の微小環境内の固有の生物的要因および非生物的要因によって遅延する可能性があり、そのため真菌の作用のパフォーマンスと速度に影響を与えます。 鳥の糞便微生物叢は、多種多様な天然微生物、すなわちファーミクテス門の細菌やプロテオバクテリア 46、子嚢菌門や担子菌門の真菌 47、その他の微生物で構成されていますが、以下の理由により各真菌株の性能に悪影響を及ぼしている可能性があります。資源の競争と菌株の分解。 土壌および糞便微小環境内での捕食性真菌の生存は、静真菌特性を持つ微生物の存在などの生物的要因の影響を受けることが示唆されています48。 さらに、デンマークで行われた研究49では、鳥回虫の卵（Ascaridia galli と Heterakis gallinarum）に対する 2 つの殺卵菌種である Pochonia chlamydosporia と Metarhizium brunneum の土壌内での捕食性能が土壌微生物叢の影響を受けることが実証されました。 生物防除アッセイを計画する際には、これらすべての要因、つまり、これらの制限要因に対抗するための胞子の最適用量を考慮する必要があります。

最後に、すべての Mucor 株が鳥の新鮮な糞便サンプルから単離され、コクシジウムのオーシストに対して興味深い溶解活性を示したので、これらの株はニワトリやクジャクの胃腸通過に抵抗し、発芽能力と捕食能力の両方を維持していることが示唆されます。鳥類では、殺卵菌である P. chlamydosporia 50 と、幼虫駆除菌 D. flagrans および Monacrossporium thaumasium 51 が以前に実証されています。 すべての Mucor 分離株が健康な鳥の糞便から得られたという事実は、他の研究者がウマ 37、ヒツジ 20、イヌ 28 およびワピティス 19 について実証したように、免疫正常な鳥に対する無害性を示唆することもできます。

我々の知る限り、この研究は、鳥の糞便から在来の捕食性真菌を単離・同定し、鳥類のアイメリア属菌に対する in vitro での有効性を試験することを目的として、世界で初めて実施されたものである。 オーシスト。 結果は、Mucor circinelloides 株 FR1 および QP2 が将来の in vitro および in vivo 生物防除試験での使用に最も有望であることを示唆しています。

放し飼いの鶏と採卵鶏 (Gallus gallusdomesticus; n = 46) およびクジャク (Pavo cristatus; n = 43) から採取した合計 89 個の糞便サンプルは、McMaster、Mini-FLOTAC、およびリスボン大学獣医学部の寄生虫学・寄生虫病研究室（LPPD）で行われた最近の研究の範囲内である共生培養物 3 では、58 サンプル（65%）が少なくとも 1 つの消化管寄生虫分類群に対して陽性であったと報告されています。すなわち、エイメリア属のコクシジウム、およびキャピラリア種、トリコストロンギルス・テヌイスおよびストロンギロイデス・パボニスなどの線虫である。 サンプルは健康な動物のものであり、胃腸疾患の臨床症状、つまり下痢および/または血を伴う便を示していませんでした。

これらのサンプルは、2020年7月から2021年4月の間に、リスボン（SJ）地区とサンタレン（QP）地区（ポルトガル）にある養鶏場（PF）と2つの外来鳥類コレクションで収集されました。 この養鶏場はリスボン北西部 (北緯 39 度 13 分 54.373 秒、西経 9 度 17 分 2.235 秒) に位置し、200 羽の放し飼い鶏と 200 羽の産卵鶏からなる 2 つの別々の個体群を飼育しています。リスボン中心部（北緯38度42分50.241秒 西経9度8分2.182秒）とアブランテス（北緯39度26分52.595秒 西経8度10分24.949秒）にそれぞれ20羽と3羽のクジャクがいます。

糞便サンプルは排泄後すぐに収集され、ビニール袋に詰められて LPPD に輸送され、さらなる処理まで最長 1 週間冷蔵庫 (4 °C) で保管されました。

LPPD とリスボン大学獣医学部真菌学研究室の両方で、胃腸寄生虫陽性の合計 58 件の鳥の糞便サンプルが糸状菌の分離と同定に使用されました。 これらのサンプルのみを使用するというアイデアは、この種の真菌が寄生虫の卵、オーシスト、幼虫を捕食して破壊する主な能力を持っているという前提に基づいており、したがってこの手順は潜在的な捕食性真菌の増殖を刺激し、寄生虫の発生を制限することになるでしょう。他の真菌グループ。

この目的のために、各糞便サンプル約 1 g を水寒天培地 (WA、2%) の表面に置き、26 °C で 3 週間インキュベートしました。 糸状菌の増殖が記録されたら、純粋培養が達成されるまで、小麦粉寒天 (WFA、2%) と 26 °C のインキュベーション サイクルを 1 週間使用して、個々のコロニーを 3 ～ 4 回の継代に供しました。 各糞便サンプルには 2 つの複製が使用されました 33。

すべての分離株は、Hernández et al.33、Arroyo-Balán et al.34、Ocampo-Gutiérrez et al.42、および Cooke および Godfrey52 に基づいて、属レベルで形態学的同定が行われました。 ラクトフェノールコットンブルー染色剤と光学顕微鏡を使用して、合計 10 個の胞子嚢と菌糸 (合計倍率 200 倍および 400 倍)、および分生子 (浸漬油中、合計倍率 1000 倍) の測定 (長さと幅) および形態の説明を実行しました。 。 また、コロニーの質感と色に関して、各分離株のコロニーの肉眼的特徴付けが行われました。

蒸留水を使用して各分離株の胞子の懸濁液を確立し、ノイバウアーチャンバーを使用して最終濃度を計算しました。 すべての真菌懸濁液は 106 胞子/mL に標準化されました。

真菌分離株は WFA を含むペトリ皿およびガラスフラスコに室温で保存し、各真菌水性懸濁液 850 μL を 15% (v/v) 滅菌グリセロール 40 を含むクライオチューブ中で -20 °C で保存しました。

すべての真菌分離株からの DNA 抽出は、EZNA® Fungal DNA Mini キット (Omega Bio-Tek、ジョージア州ノークロス) を使用して実行されました。 校正済みの 1 μL 綿棒を使用して、各真菌分離株から新鮮な菌糸体を収集しました。 この手順を５回繰り返し、総菌糸体積をそれぞれの２ｍＬ微量遠心管に入れ、これに６００μＬの溶解緩衝液ＦＧ１も加えた。 混合物をボルテックスしてすべての塊を分散させ、65 °C で 10 分間インキュベートしました。 次いで、１４０μＬのＦＧ２緩衝液（氷酢酸）を加え、懸濁液をボルテックスした。 チューブを氷上で 5 分間インキュベートし、その後 10,000 × g で 10 分間遠心分離しました。 上清を新しい微量遠心管に移し、そこに0.7容量のイソプロパノールも加えた。 ボルテックス後、懸濁液を 10,000 × g で 2 分間遠心分離しました。 上清を除去し、各DNAペレットに滅菌蒸留水300μLを加えてボルテックスした。 合計 4 μL の RNase A を各チューブに加え、続いて 150 μL の FG3 緩衝液 (グアニジン塩酸塩) および 300 μL の 100% エタノールを、常にボルテックスを使用して懸濁液を混合しながら加えました。 HiBind® DNA Mini Columns を使用してさらなるステップを実行し、可逆的な核酸結合により真菌溶解物から多糖類、フェノール化合物、および酵素阻害剤を除去しました。 純粋な DNA を 200 μL の滅菌蒸留水で溶出し、NanoDrop™ (Thermo Fisher Scientific Inc.、ウォルサム、米国) を使用してその純度および濃度をチェックしました。 チューブは最終的に -20 °C で保管されました。

rDNA の増幅は、10 ～ 66 ng のゲノム DNA とプライマー ITS1 (TCC GTA GGT GAA CCT GCG G) および ITS4 (TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC) を使用して、ITS1-5.8S-ITS2 領域をターゲットとする各分離株に対して実行されました。 これらの手順は、Arroyo-Balán et al.34 および Lau et al.53 によって記載されたガイドラインに従い、PCR 反応は、0.4 μL ITS1 (0.8 μM)、0.4 μL ITS4 (0.8 μM) で構成される 25 μL 容量で実行されました。 ）、10μLのDNAテンプレート、10μLのNZYTaq IIグリーンマスターミックス（NZYTech、リスボン、ポルトガル）および4.2μLの分子生物学水。 DNAを水に置き換えたネガティブコントロールも使用しました。

サーモサイクル条件は次のとおりです: 95 °C で 10 分間の初期変性ステップ、その後 94 °C で 15 秒間の変性ステップ、55 °C で 30 秒のアニーリング ステップ、および伸長ステップで構成される 60 サイクル72℃で30秒間。 最後に、伸長ステップを 72 °C で 5 分間実行しました。 アンプリコンはアガロースゲル (1.5%) 電気泳動によって分析され、2.5 μL の GreenSafe Premium (NZYTech) で染色され、NZY​​DNA Ladder VI (50 ～ 1500 bp; NZYTech) が含まれていました。 ゲルを８５Ｖで４０分間実行し、装置ＣｈｅｍｉＤｏｃおよびＩｍａｇｅ Ｌａｂ（商標）ソフトウェア（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、カリフォルニア、米国）を使用して視覚化した。

各 PCR 産物は、DNA 沈殿のために磁気ビーズ (MCLAB、カリフォルニア、米国) を使用して精製し、続いて 85% エタノールでペレットを洗浄し、続いて MiliQ 水で溶出しました。 得られた上清をさらなる配列決定に使用しました。 精製された PCR 産物は、ITS1 プライマーおよび BigDye™ Terminator バージョン 3.1 Cycle Sequencing Kit を使用し、さらに装置 DNA Analyzer 3730 XL (Thermo Fisher Scientific Inc.) を使用して配列決定されました。

配列は、Chromas Software バージョン 2.6.6 (Technelysium Pty, Ltd.、サウス ブリスベン、オーストラリア) を使用して評価し、クロマトグラム内のヌクレオチドの明確に定義されたピークに基づいてその品質をチェックしました。 次に、国立バイオテクノロジー情報センター (NCBI) の Blastn Suite (BLAST®) を使用して配列をブラストし、重要な配列アラインメントの予備分析を実行し、系統解析における比較目的で真菌分類群を選択しました。 各真菌分離株について、Blastn Suite の結果に基づいて配列類似性のトップ 3 が確立されました。

MEGA ソフトウェア バージョン 11.0.1154 を使用して配列を手動で編集し、配列の品質と未検出のヌクレオチドをチェックし、プライマーを除去し、MUSCLE アルゴリズムを使用してアラインメントを実行しました。 BLAST® 検索に基づいて、分離株 Mucor circinelloides CBS 195.68 (アクセッション番号: NR_126116.1)、Mucor lusitanicus CBS 108.17 (アクセッション番号: NR_126127.1)、Mucorracemosus f. からの ITS1-5.8S-ITS2 領域配列が得られました。 racemosus CBS 260.68 (アクセッション番号: NR_126135.1) および Mucor fragilis (アクセッション番号: FJ904925.1) も含まれていました。 IQ-TREE Web サーバー55 を使用して、1000 の複製から最尤系統樹を生成しました。 IQ-TREE の ModelFinder オプションは、最適なモデルを自動決定するように設定されました56。 超高速ブートストラップ ツール (1000 のブートストラップ アライメント) がノード サポート統計を取得するために選択され、そのブランチは 5057 を超えるブートストラップ値によってのみサポートされます。系統樹は MEGA ソフトウェアを使用して視覚化および編集され、ツリーのルートとして M.racemosus が選択されました。なぜなら、最初の最尤系統樹では、この参照株は明らかに他の真菌分離株および参照株からより系統的に離れており、この株と中間点の両方でツリーを根付かせると同一の系統樹が得られるからです。

7 つの真菌分離株すべての ITS1-5.8S-ITS2 ヌクレオチド配列は、次のアクセッション番号で GenBank データベースに寄託されました: ON150886 (M. circinelloides、FR1)、ON150887 (M. circinelloides、FR2)、ON150888 (M. circinelloides、 FR3)、ON150889 (M. ルシタニクス、QP1)、ON150890 (M. circinelloides、QP2)、ON150891 (M. circinelloides、SJ1)、および ON150892 (M. circinelloides、SJ2)。

鳥コクシジウムに対するすべての真菌分離株の捕食活性を試験することを目的として、2 種類の生物防除試験が実施されました。WA 培地を含むペトリ皿での定性アッセイと、定量的・定性的な共生培養アッセイです 33。

オーシストの濃縮懸濁液を得るために、アイメリア属菌陽性のニワトリ、産卵鶏およびクジャクからの糞便サンプルをウィリス浮選法を用いて処理した。 簡単に説明すると、2 グラムの糞便を 28 mL の飽和スクロース溶液 (比重 1.2) と混合しました。 糞便懸濁液を濾過し、凸状のメニスカスが形成されるまで10 mLの試験管に注ぎ、その上にカバースリップを置きました。 試験管を実験台に 10 分間放置し、カバースリップを蒸留水で洗浄して新しい試験管に移し、2000 rpm で 10 分間遠心分離しました。 上清を部分的に除去し、各チューブに 1 mL だけを残しました。 パスツールピペットを使用して沈殿物と上清を混合し、光学顕微鏡を使用して合計倍率400倍でオーシスト懸濁液100μLを視覚化した。 2 回の読み取りを実行し、総オーシスト数に 10 を掛けてコクシジウム濃度 (つまり、オーシスト/mL) を計算しました。

最初のアッセイでは、総量 500 μL の各真菌分離株 (106 胞子/mL) を WA 培地の表面に接種し、これに 1 mL のオーシスト懸濁液も添加し、平均濃度は 140 オーシスト/mL でした。 。 各分離株に対して 2 つの複製を使用し、真菌を接種しない場合のオーシストの生存を評価し、他の真菌種による汚染をテストするために陽性対照も使用しました。 プレートをパラフィルムで密封し、室温で30日間インキュベートした。 次に、捕食活動を同定するためにプレートを観察しました。この活動は次のように特徴づけられました。菌糸はオーシストの被膜に付着しているが、形態学的損傷はありません (活動タイプ 1)。 オーシストのカプセルと内部構造は形態学的変化を示していますが、真菌の侵入はありません（タイプ 2）。 菌糸はオーシストの細胞質に侵入し、内部で成長し、それを破壊します（タイプ 3）27、33、58。

2 番目のアッセイは、糞便微小環境への曝露後のオーシストの分解に対する真菌分離株の有効性を評価することを目的としました。 エキゾチックコレクション SJ からのクジャクの糞便サンプル 4 グラム、アイメリア属の陽性。 (n = 20) を穏やかに混合し、8 つのプラスチックカップに入れました。 合計 4 mL の真菌懸濁液 (106 胞子/mL) をそれぞれのテスト カップ (真菌分離株あたり 1 つ、n = 7) に加え、4 mL の蒸留水を対照カップ (n = 1) に注ぎました。 次に、カップを穴あきアルミホイルで覆い、26 °C で 2 週間インキュベートしたままにしました。 1 週間と 2 週間のインキュベーション後、サンプルの異なる部分からランダムに採取した糞便 2 g を使用し、それを飽和スクロース溶液 (比重 1.2) 28 mL と混合して、各テスト カップとコントロール カップで 2 回の浮選を実行しました。胞子形成/非胞子形成および生存/非生存オーシストの割合(1週間後)および生存/非生存オーシストの割合(各週)を計算します。 各カップおよび時間枠で 2 回の読み取りを実行し、読み取りごとに合計 100 個のオーシストを数えました。

各真菌分離株および期間 (7 日および 14 日) について、糞便オーシスト生存率減少 (FOVR) (1) および糞便オーシスト胞子形成減少 (FOSR) (2) は次のように計算されました 19,20,59:

オーシストの外観の特徴付けは、Cazapal-Monteiro et al.27 によって回虫の卵に対して確立された手順に基づいて行われ、以下の特徴の少なくとも 1 つが観察された場合、オーシストは生存不可能であると考えられます: 内部構造が不十分にマークされている、オーシストの形状が異常である、液胞を含む細胞質、および/またはカプセルの破壊。

また、ガリ目目に影響を与えるほとんどのアイメリア種は、20 ～ 30 °C の温度範囲で 2 日以内に胞子形成するため 5,60、FOSR 評価は次の基準に従って実行されました。試験カップ内の胞子形成されていないオーシストの割合は、それぞれの真菌分離株への曝露によって発現したコクシジウム抑制活性に起因すると考えられました。

ソフトウェア Microsoft® Excel® for Microsoft 365 MSO (Microsoft Corporation、米国ワシントン州レドモンド) を、データの保存と表およびグラフの編集に使用しました。

ソフトウェア IBM® SPSS® Statistics バージョン 27 for Windows (IBM Corporation、ニューヨーク州アーモンク、EUA) を最初の記述統計 (平均誤差および標準誤差) に使用しました。 また、このソフトウェアは、カイ二乗検定を実行することを目的として、in vitro 試験 (生存率と胞子形成) からのデータを使用して 2 × 2 の表を作成し、各真菌分離株 (テスト カップ) に曝露されたオーシスト間で得られた結果を比較するために使用されました。 ）そして水（コントロールカップ）に注ぐ。 さらに、この試験は、各真菌分離株がオーシスト上で発現する殺卵活性の時間依存性を評価するために使用されました。 すべての検定に有意水準 p < 0.05 を使用しました。

現在の研究中に生成および/または分析されたデータセットは、リスボン大学獣医学部の動物衛生学際研究センター (CIISA) に属しています。 7 つの Mucor 分離株すべてから得られた rDNA 配列は、2022 年 4 月 5 日に GenBank データベースにアップロードされ、アクセッション番号は「方法」セクションに提供されました。 すべてのデータは、対応著者にリクエストすることで利用可能になります。

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この研究は、CIISA/FMV プロジェクト UIDB/00276/2020 および LA/P/0059/2020—AL4AnimalS (どちらも FCT からの資金提供)、およびプロジェクト ED431B 2021/07 (Consellería de Cultura、Educación e Universidades、Xunta) の資金提供を受けました。デ・ガリシア）。 また、João LozanoとMariana Louroは、それぞれPhD Research Fellowships 2020.09037.BDとUI/BD/152818/2022を保有しています(どちらもFCTの資金提供による)。 この研究に支援を提供していただき、また、微生物学と免疫学研究所（CIISA-FMV、リスボン、ポルトガル）とそのリーダーであるイザベル・フォンセカ教授とルイス・タバレス教授にそれぞれ感謝いたします。それぞれの施設で実施します。 また、捕食性真菌の分離と同定、および in vitro 試験に関するあらゆる支援をしていただいた COPAR 研究グループ (スペイン、ルーゴのサンティアゴ デ コンポステーラ大学獣医学部) に特別に感謝いたします。 最後に、STAB VIDA、Lda に感謝の意を表します。 （Caparica、ポルトガル）は、真菌の PCR 産物の精製と配列決定に使用されます。

CIISA—動物衛生学際研究センター、リスボン大学獣医学部、Avenida da Universidade Técnica、1300-477、リスボン、ポルトガル

ジョアン・ロサーノ、マリアナ・ロウロ、アナ・クラウディア・ヴィクトリオ、マヌエラ・オリベイラ、ルイス・マデイラ・デ・カルヴァーリョ

動物および獣医学準研究所 (AL4AnimalS)、1300-477、リスボン、ポルトガル

ジョアン・ロサーノ、マリアナ・ロウロ、アナ・クラウディア・ヴィクトリオ、マヌエラ・オリベイラ、ルイス・マデイラ・デ・カルヴァーリョ

Exoclinic – Bird and Exotic Veterinary Clinic、Quinta de Santo António、1495-049、ミラフローレス、ポルトガル

クリスティーナ・アルメイダ

Vetnatura – Serviços Veterinários, Lda.、Calçada de Palma de Baixo、1600-176、リスボン、ポルトガル

ペドロ・メロ

Bark – Biopark Ba​​rquinha、2260-999、Vila Nova da Barquinha、ポルトガル

ジョアンパウロ・ロドリゲス

寄生虫制御研究グループ (COPAR、GI-2120)、サンティアゴ デ コンポステーラ大学獣医学部動物病理学教室、27142、ルーゴ、スペイン

アドルフォ・パス＝シルバ

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JL は研究を設計し、リソースを提供し、実験を実施し、データを厳選し、結果を分析し、原稿の初稿を書きました。 ML はリソースを提供し、結果を分析し、原稿を修正しました。 CA はリソースを提供し、原稿を改訂しました。 ACV はリソースを提供し、原稿を改訂しました。 PM はリソースを提供しました。 JPR がリソースを提供しました。 MO はリソースを提供し、実験に協力し、原稿を改訂し、研究を共同監督しました。 APS はリソースを提供し、実験に協力し、原稿を改訂し、研究を共同監督しました。 LMC はリソースを提供し、実験に協力し、原稿を改訂し、研究を監督しました。 著者全員がこの原稿を読み、投稿することに同意しました。

ジョアン・ロサーノへの通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

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転載と許可

Lozano、J.、Louro、M.、Almeida、C. 他。 鳥類の糞便サンプルからの腐生糸状菌の単離とコクシジウムオーシストに対するその捕食活性の評価。 Sci Rep 13、8965 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41598-023-36120-5

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受信日: 2022 年 12 月 24 日

受理日: 2023 年 5 月 30 日

公開日: 2023 年 6 月 2 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-36120-5

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