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Jan 02, 2024

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Rapporti scientifici Volume 13,

Scientific Reports volume 13、記事番号: 8667 (2023) この記事を引用

448 アクセス

1 オルトメトリック

メトリクスの詳細

トキソプラズマ・ゴンディ（T. gondii）の感染は、社会経済的および公衆衛生上の大きな課題を抱えているヒトおよび動物において世界的に増加し続けています。 T. gondii 感染症に対して現在使用されている薬剤は、有効性、安全性、手頃な価格の点で限界があります。 この研究は、インビトロで T. gondii タキゾイトの増殖に対する高度な真菌抽出物の効果を評価し、おそらくその作用機序を解読するために行われました。 さらに、ヒト包皮線維芽細胞の生存率に対する抽出物の効果を評価しました。 ターキーテール（TT）キノコのメタノール抽出物は、蛍光プレートリーダーを使用し、用量依存的に培養全体を通じて赤色蛍光タンパク質を発現するRH-RFP I型株を使用して、T.ゴンディタキゾイトの増殖に対してテストされました。 同様に、宿主細胞の生存率に対する抽出物の影響をテストしました。 TT 抽出物は、50% の最小阻害濃度 (IC50)、IC50 = 5.98 ± 1.22 μg/mL、および 50% の細胞毒性濃度 (CC50)、CC50 ≥ 100 μg/mL でタキゾイトの増殖を阻害することが観察されました。 TT 抽出物が強力なミトコンドリア スーパーオキシドと活性酸素種の生成を誘導し、T. gondii タキゾイトのミトコンドリア膜電位を破壊することが発見されました。 さらに、走査型電子顕微鏡により、TT 抽出物とピリメタミン (PY) が in vitro でタキゾイトの形態的変形を引き起こすことが示されました。 結論として、フィトステロール、生理活性スフィンゴ脂質、ペプチド、フェノール酸、ラクトンで構成される TT メタノール抽出物は、将来の抗トキソプラズマ ゴンジ薬開発のための新しい化合物の有望な供給源となる可能性があります。 抽出物は、高濃度でも細胞毒性がありませんでした。

トキソプラズマ症は、単細胞原虫である T. gondii によって引き起こされる、眼の先天性神経寄生性疾患です。 T. gondii 感染は人間と動物の間で世界的に蔓延しています 1、2、3。 T. gondii は顧みられない寄生虫であると考えられていますが、ヒトや動物への感染は世界的に公衆衛生、獣医学、社会経済問題に寄与しています 1,4。 CDC によると、この寄生虫は妊婦やその胎児、免疫力が低下している人々に健康を脅かす合併症を引き起こす可能性があります4。 米国だけでも、4,000 万人以上がこの成功した人獣共通寄生虫に感染している可能性があると推定されています4。

最近の研究では、ネコ科のネコ科動物の血清有病率は世界的に 35 ～ 75% であることが示されています5。 この寄生虫に関連する最も憂慮すべき問題は、食物に結合した肉や動物や鳥の製品に寄生虫が存在することが増加していることです1。 高速複製型（タキゾイト）の治療に最も推奨される薬剤は、葉酸拮抗薬（ピリメタミンやスルファジアジン）です4、6、7。 しかし、この組み合わせやその他の組み合わせにはいくつかの毒性の問題があることが報告されており、タキゾイト段階での治療の失敗は成長の遅い段階（ブラディゾイト）を排除するものではなく6、7、8、貧しい地域では費用がかかります9。 これらの数多くの課題の増大と、家畜と野生動物、鳥類の血清有病率の上昇、および人間の免疫力の低下を引き起こす可能性のある病気の出現の増加の結果として、共寄生虫に対するさらなる開発のための新しい栄養補助食品や化合物の発見が求められています。感染症はますます重要かつ必要なものとなっています。

植物、藻類、真菌ベースの抽出物とその代謝物には、効果的で安全な抗寄生虫剤としてさらに開発される可能性のある抗寄生虫化合物の有望な供給源があることが報告されています10、11、12、13、14、15、16。 17.

多孔性キノコとして分類されるトラメテス癜風キノコは、世界中で膨大な薬用用途があります18。 薬効以外にも、必須タンパク質、多糖類、ステロールとその誘導体、生理活性スフィンゴ脂質、トリテルペノイド、ペプチドが豊富に含まれており、高い抗酸化特性を持っています15、16、19、20、21、22、23。 より具体的には、カワラタケは抗寄生虫特性（例えば、リーシュマニア属に対する）を有することが報告されている15、16。 他にも、その広範な抗腫瘍特性が報告されています 24,25。 しかし、インビトロでの T. gondii タキゾイトの増殖に対するこのキノコの影響とその作用機序についての証拠は存在しませんでした。 真菌（キノコ）の抗 T 剤に関するこの分野で知られている唯一の研究。 gondii 活性は、真菌 Trichoderma stromaticum を使用した研究です 26。 この研究では、研究者らは、in vitro で T. gondii の複製が減少し、in vivo で実験的トキソプラズマ症が改善することを観察しました26。 このキノコ (TT) の化学的特性、栄養と健康特性、および抗リーシュマニア属菌活性に関するこれまでの研究やその他の研究に基づいて、その抗リーシュマニア属菌活性を調査することに私たちは興味を持ちました。 ゴンディの特性を解析することで、特に発展途上国において人獣共通感染症の寄生虫を管理するための安全で効果的な栄養補助食品として開発できるかどうかを解明することができます。開発途上国では、これらの寄生虫の血清有病率が非常に高く、キノコが豊富に存在します。

この研究では、T. gondii タキゾイトにおける七面鳥の尾のキノコ抽出物の阻害活性の効果を調査し、その細胞毒性効果を評価しました。 また、我々は、インビトロでの T. gondii に対するキノコ抽出物の阻害活性の可能性のある予備的な作用機序を提示する。

この研究で使用されたキノコ標本[Trametes versicolor (Turkey-tail)]は、2018/2019年にタスキーギで収集され、米国アラバマ州タスキーギのタスキーギ大学所属の菌学者であるフレデリック・ラファイエット博士によって同定されました。 このキノコの標本は、米国アラバマ州モンゴメリーにあるアラバマ州立大学のダニエル・アブグリ博士の研究室にあります。 キノコをメタノールで 37 °C で 3 日間抽出し、ワットマン濾紙 1 番を使用して濾過しました。残留物を 150 mL のメタノールでさらに 3 回再抽出しました。 すべての濾液を一緒に集め、窒素蒸発器／ドラフトを使用して乾燥させ、約０．５ｇの粗抽出物を得た。 粗抽出物を 2.54 mg/mL の割合で DMSO に溶解し、駆虫薬の研究まで -20 °C で保存しました。 生物学的アッセイ用の抽出物の各希釈液中の DMSO のパーセントは 0.1% でした。

ニュージャージー州シルバ博士から入手したヒトテロメラーゼ逆転写酵素（hTERT）不死化ヒト包皮線維芽細胞（HFF）細胞。 Moreno (ジョージア大学、アテネ、ジョージア州) は、5% (v/v) ウシ胎児血清 (FBS)、200 nM L-グルタミンおよび 1% (v/v) を補充したフェノールレッドを含まないダルベッコ変法イーグル培地 (DMEM) を使用して維持されました。 v) ペニシリン - ストレプトマイシン (Life Technologies、米国) から入手し、5% CO2 および 95% 大気中で 37 °C でインキュベートしました。 T. gondii (ジョージア州アセンズにあるジョージア大学の Silvia NJ Moreno 博士のご厚意により提供された、培養内で赤色蛍光タンパク質を発現する I 型株、RH-RFP または RH-W、野生型) が、すべての実験で使用された株タイプでした。実験。 T. gondii タキゾイトを 27 ゲージの針に通し、続いて 3 μm フィルターで濾過することによって収集しました。

6 × 104 hTERT 細胞/200 μL/ウェルを黒色の平底 96 ウェルプレートに播種し、37 °C、5% CO2 で 24 時間インキュベートしました。 死細胞は、1Xリン酸緩衝生理食塩水(1XPBS)で3回洗浄することによって除去した。 ウェルを、100μLの培地と、0、0.78、1.53、3.06、6.125、12.5、25、および50μg/mLから始まる濃度で調製した100μLのTT抽出物で再充填した。 ＰＹ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．、米国テキサス州ダラス）を標準対照として使用し、同等の濃度範囲をμｇ／ｍＬで試験した。 プレートを 37 °C、5% CO2 で 72 時間インキュベートしました。 次に、10 μL の Alamar Blue (Abcam、Waltham、MA、USA) 色素をウェルに添加し、プレートをアルミホイルで包み、標準的な培養条件で 1 時間インキュベートしました。 次に、プレートをインキュベーターから取り出し、各ウェルの蛍光強度をそれぞれ485/535 nmの励起/発光波長で測定した。 宿主細胞生存率パーセントは、処理細胞の蛍光強度をブランク（薬物を含まない細胞を含む培地）と比較することによって計算され、グラフパッドプリズムソフトウェアを使用して決定されたCC50値。 実験は、実験ごとに 3 つの独立したウェルを使用して 4 つ (n = 4) で実行されました。

TT 抽出物の抗寄生虫特性をテストするために、細胞毒性アッセイで詳述されているように、6 × 104 hTERT 細胞/200 μL/ウェルを播種しました。 細胞が接着してコンフルエントになってから 24 時間後、存在する死細胞を 1X PBS で 3 回洗浄することによって注意深く除去しました。 6 × 104 タキゾイト/100 μL の T. gondii RH-RFP Type I 株を各ウェルに添加し、37 °C、5% CO2 で 3 時間インキュベートしました。 細胞外寄生虫を、1X PBSで3回洗浄することによって除去した。 洗浄後、100 μL の TT 抽出物または PY を、TT 抽出物については 0 ～ 50 μg/mL の範囲の濃度で添加し、PY については標準対照として 0 ～ 50 μM を使用しました。 培地のみをネガティブコントロールとして使用した。 プレートを 5% CO2、37 °C でインキュベートし、励起/発光をそれぞれ 560 nm/635 nm に設定した Tecan 200 F 無限マイクロプレートリーダーを使用して 48 時間で読み取りました28。 寄生虫の増殖率は、次の式で計算されました: (対照寄生虫増殖の平均蛍光 - 薬物処理寄生虫増殖の蛍光 / 寄生虫対照増殖の平均蛍光) × 100。 阻害パーセントは、Huffman らによって報告された手順を使用して決定されました。アル.28。 実験は、実験ごとに 3 つの独立したウェルを使用して 4 つ (n = 4) で実行されました。

1 × 105 タキゾイト (100 μL) の T. gondii RH-Wild type I 株を各黒色平底 96 ウェル プレートに添加しました。 1.56 および 50 μg/mL の TT 抽出物、500 μM の過酸化水素 (H2O2) を陽性対照として使用し、培地のみを陰性対照として各ウェルに同量の 100 μL 培地とともに加えました。 プレートを 37 °C、5% CO2 で 30 分間インキュベートしました。 5μMのCell ROX™ Purple試薬（Invitrogenカタログ番号C10443）10μLを加え、プレートをアルミホイルで包み、37℃で30分間インキュベートした。 蛍光強度は、Tecan 200 F 無限マイクロプレートリーダーを使用し、励起を 560 nm、発光を 635 nm に設定して測定しました。 実験は 3 回繰り返して実行されました (n = 3)。

細胞外寄生虫によるミトコンドリア スーパーオキシド産生を評価するために、1 × 105 タキゾイト/100 μL の T. gondii RH-W (野生型) I 型株を黒色平底 96 ウェル プレートの各ウェルに添加しました。 次に、指定されたウェルに 1.56 および 50 μg/mL の TT 抽出物を添加し、500 μM H2O2 を陽性対照として使用し、培地のみを陰性対照として使用しました。 プレートを37℃、5% CO2下で3時間インキュベートしました。 インキュベーション後、米国 Invitrogen が提供する MitoSOX™ Red ミトコンドリア スーパーオキシド インジケーター (M36008) プロトコルに従って、5 μM の MitoSOX™ 試薬 50 μL を各ウェルに添加し、アルミホイルで包み、37 °C で 30 分間インキュベートしました。 。 実験ウェルの蛍光強度は、励起を485 nm、発光を535 nmに設定したTecan 200 F 無限マイクロプレートリーダーを使用して読み取られました。 実験は 3 回繰り返して実行されました (n = 3)。

TT 抽出物によって示される高いスーパーオキシド生成が T. gondii ミトコンドリア膜電位に影響を与えるかどうかを調べるために、カチオン性プローブ JC-1 (Thermo Fisher Scientific、米国カリフォルニア州ウォルサム) アッセイを使用しました。 ここでは、T. gondii RH 野生型 I 株からの 1 × 105 の新たに精製したタキゾイト / 50 μL 培地を、平らな黒い底の 96 ウェル プレート (Costar、Corning Inc.、NY、USA) に播種しました。 次に、実験薬物として 1.56 および 50 μg/mL の TT、陽性対照として 50 μM のシアン化カルボニル m-クロロフェニル ヒドラゾン (CCCP、Alfa Aesar、Haverhill、MA、USA 製) を含む 50 μL 溶液、およびアッセイ緩​​衝液を加えます。 (AB) をネガティブコントロールとしてウェルに添加し、続いて 5% CO2 存在下、37 °C で 8 時間インキュベートしました。 10μLのJC-1をウェルに添加し、反応プレートをアルミホイルで覆い、45分間インキュベートした。 その後、12℃で2000rpm、5分間遠心分離し、上清を除去し、100μLのアッセイバッファー（フェノールレッドを含まないハンクス平衡塩類溶液（HBSS））を各ウェルに加え、同じ温度で遠心分離した。状態と上清の除去。 次に、100μLのアッセイ緩​​衝液を添加して、溶液中に寄生虫を懸濁した。 Tecan 200 F 無限マイクロプレートリーダーを使用して、寄生虫の蛍光を、JC-1 J 凝集体については 560/635 nm (590 nm)、JC-1、J モノマーについては 485/535 nm (529 nm) で読み取りました。 モノマーの蛍光値に対する J 会合体の蛍光値の比は、次の式を使用して計算されました: J 会合体の相対蛍光単位 (RFU) (赤)/J モノマーの RFU (緑)。 EVOS FL 蛍光顕微鏡 (Invitrogen Life Technologies、米国カリフォルニア州カールズバッド) を使用して、各治療グループの画像を撮影しました。 実験は 3 回 (n = 3) 行われ、グラフが作成されました。

6 ウェル プレート (ウェル上にカバースリップ付き) のウェルごとに、Vero 細胞 (1 × 105) のコンフルエントな単層を調製しました。 次に、T. gondii RH-W 株の 1 × 105 タキゾイトを、1.56 および 50 μg/mL の TT および 0.38 および 12.4 μg/mL の PY とともに各ウェルに添加しました。 プレートを 37 °C、5% CO2 で 48 時間インキュベートしました。 次いで、細胞を1X PBSで洗浄し(3回)、2.5%グルタルアルデヒドで処理し、4℃で一晩維持した。 次に、タキゾイトを含むベロ細胞を 1X PBS で洗浄し (3 回)、1% 四酸化オスミウムを加えて暗所に 1.5 時間静置しました。 次に細胞を 1X PBS で洗浄し (3 回)、段階的エタノールシリーズ (例: 50%、70%、90%、100%) で脱水し、100% アセトンに移し、ドラフト内で風乾しました 32。 脱水後、サンプルを金でスパッタリングし、Zeiss EVO 50 走査型電子顕微鏡 (Carl Zeiss Microscopy、米国ニューヨーク州ソーンウッド) を使用して画像化しました。

分析は、Xcalibur ソフトウェア (V4.4.16.14) を使用して、ポジティブおよびネガティブ モードのエレクトロスプレー イオン化 (H-ESI) を備えた四重極オービトラップ質量分析計 (Orbitrap Exploris 120、Thermo) と組み合わせた Vanquish UHPLC システム (Thermo Fisher、米国) で実行されました。 ）。 10 μL の TT 抽出物 (2.54 mg/mL) を、溶液 A ( 50% 水 50% メタノール中の 0.1% ギ酸) および溶液 B (0.05% ギ酸を含む 50% アセトニトリルおよび 50% イソプロパノール) 30%B から開始して 1 分間で 50%B まで、続いて 100%B までの直線勾配13 分で反応し、3 分間保持し、その後 30%B に戻し、3 分間再平衡化しました (合計時間 21 分)。 スプレー電圧は、ポジティブモードでは 3.5 kV、ネガティブモードでは 3.0 kV に設定されました。 メタノール性 TT 抽出物を各モードで 1 回ずつ、2 回注入しました。 シースガスを 30、補助ガスを 20、スイープガスを 0 (すべて任意の単位)​​ に設定し、気化器温度とイオン移送管温度をそれぞれ 300 ℃と 350 ℃に設定しました。 オービトラップ分解能は、強度閾値 20,000、自動動的排除、およびブランク注入に基づくターゲット排除質量リストによる 4 つの依存スキャンを使用して、MS では 120,000、DDA MS/MS では 15,000 に設定されました。 EASY-IC は、115 ～ 1000 Da の範囲の MS スキャンに対してオンでした。 衝突エネルギーは正規化され、最大射出時間を自動に設定して 10、40、および 100 で段階的に設定されました。 植物化学分析は、アラバマ州オーバーンにあるオーバーン大学研究質量分析施設で行われました。

サンプルは、カロテノイド データベース、ヒト メタボローム データベース、および LipidMAPS を使用した天然物と非ターゲット メタボロミクス ワークフローを使用して、Compound Discoverer 3.2 で処理されました。

IC50 および CC50 は、Graph Pad Prism ソフトウェア バージョン 9.4.1 を使用して取得されました。 平均値の比較は、アルファ値を 0.05 に設定した Tukey の多重比較検定を使用して実行されました。

この研究では、抗T. in vitro での七面鳥尾 (Trametes versicolor) キノコ抽出物の gondii 阻害活性。 TT 抽出物の IC50 と CC50 は、それぞれ IC50 = 5.98 ± 1.22 μg/mL、CC50 ≧ 100 μg/mL と計算されました。 研究の品質管理のために、標準対照としてピリメタミン (PY) を使用しました。これにより、IC50 = 4.98 ± 0.49 μM (1.22 ± 0.12 μg/mL)、CC50 ≧ 50 μM (12.44 μg/mL) が得られました (表 1)。

48 時間の T. gondii 阻害曲線を補足の図 1 に示します。

得られた有効な寄生虫阻害結果が TT 抽出物に含まれる二次代謝産物のみによるものであり、タキゾイト増殖に対する細胞変性効果の結果ではないことを確認するために、寄生虫阻害アッセイで使用したものと同じ濃度を使用して宿主細胞生存率試験を実施しました。 。 結果を表 1 に示します。興味深いことに、試験した TT 抽出物および PY 濃度は、48 時間の T. gondii タキゾイト阻害について得られた IC50 濃度では宿主細胞に対して細胞毒性がありませんでした (表 1)。

ミトコンドリアは T. gondii のエネルギー充足にとって重要な細胞小器官であり、この研究では TT 抽出物がミトコンドリア膜電位の低下を誘導することが判明し (図 1)、これがエネルギーに依存する寄生虫の生存と複製に影響を与えた可能性があることを示唆しています。 ネガティブコントロール（アッセイバッファーのみ）と 1.56 µg/mL TT 抽出物（p < 0.0001）、アッセイバッファーのみと 50 µg/mL TT 抽出物（p = 0.0038）、およびアッセイバッファーのみとポジティブコントロールの間に統計的な差異がありました（ CCCP) (p < 0.0001)。 さらに、CCCP (陽性対照) を使用したミトコンドリア膜電位破壊と、試験した選択された濃度の TT の間には、p < 0.0001 で統計的な差がありました (図 1)。

TT 抽出物、アッセイバッファー (ネガティブ コントロール)、およびポジティブ コントロールとしてシアン化カルボニル m-クロロフェニル ヒドラゾン (CCCP) での JC-1 凝集体 (560/635 nm) と JC-1 モノマー (485/535 nm) の蛍光の比。 **、****は、試験した濃度と使用した対照との間の有意差を示し、それぞれp < 0.01およびp < 0.0001です。

TT 抽出物は、インビトロで T. gondii においてミトコンドリア スーパーオキシドの生成を引き起こすことが判明しました (図 2)。

T.ゴンディ・タキゾイトのミトコンドリア・スーパーオキシド生成に対する七面鳥尾キノコ抽出物の効果。 ** は p < 0.01 の有意性を示します。 プレートリーダーは、485/535 nm の励起/発光スペクトルを使用しました。 有意差はありません。

重要なことに、キノコ抽出物はタキゾイト ミトコンドリア スーパーオキシドの生成を引き起こし、ネガティブ コントロール (培地のみ) p < 0.01 とポジティブ コントロール (H2O2) p < 0.0001 の間に強い統計的差異がありました。

TT の 50 μg/mL メタノール抽出物は、in vitro で培地 (陰性対照) と比較してタキゾイトでの活性酸素種の生成が高いことがわかりました (p < 0.0001)。 同様に、ポジティブコントロール（500μMのH2O2）ROS生成は、培地（ネガティブコントロール）処理タキゾイトROS生成と比較して統計的に異なりました（p<0.0001）。 1.56 μg/mL と培地 (陰性対照) の間には、p < 0.001 で有意な差がありました。 反対に、TT 抽出物の低濃度および高濃度の両方によって生成された ROS は濃度に依存しませんでした。

T. gondii tachyzoites の活性酸素種 (酸化ストレス) 生成に対する七面鳥の尾のキノコ抽出物の影響。 *** および **** は、それぞれ p < 0.001 および p < 0.0001 の有意性を示します。 有意差はありません。

走査型電子顕微鏡 (SEM) を使用して、ベロ細胞内の T. gondii タキゾイトの外部形態に対する TT および PY の効果を評価しました。 処理されたタキゾイトはフック (伸長) を伴って比較的膨らんでいました。 微小孔（正常なエンドサイトーシスの主要な入り口）は、その三日月形とともに、より多くの穴、深い吹き出物、しわを特徴とする、異常に潰れ、穴が開き、崩壊した形状に変化しています（図4A〜H）。 これらの効果は、低濃度の薬剤（TT 1.56 μg/mL および PY 0.38 μg/mL）と比較して、使用した薬剤の高濃度（TT 50 μg/mL および PY 12.44 μg/mL）でより顕著でした（図 4A ～ H)。 対照（未処理）タキゾイトは、滑らかで規則的で完全な外面を特徴とする典型的な三日月形をしていることがわかりました（図4I-J）。 結果のパターンは、T. gondii32 を阻害することが判明した化合物の効果に関する以前の結果と一致していました。

1.56 μm (0.38 μg/mL) の PY (A、B)、50 μm (12.4 μg/mL) の PY (C、D)、1.56 μg/mL で処理した T. gondii タキゾイトの走査型電子顕微鏡 (SEM) 顕微鏡写真ＴＴ（Ｅ、Ｆ）、５０μｇ／ｍｌのＴＴ（Ｇ、Ｈ）および陰性対照としての培地（Ｉ、Ｊ）。 H フック、C 細胞崩壊/崩壊、M 膜破壊/穿孔。 長い赤い矢印は穴を示し、短い白い矢印はしわを示し、短い赤い矢印はディンプルを示します。 緑色の矢印は、典型的な細胞内タキゾイトの通常の頂点状の滑らかで規則的なサイズを示します。

質量分析分析により、TT 抽出物にはフィトステロール、エルゴスタン、ラノスタン、ペプチド、脂肪酸、トリテルペノイド、フェノール酸、脂質 (リン脂質およびスフィンゴ脂質)、およびビタミンが含まれていることが明らかになりました (表 1)。

伝統的に、トキソプラズマ症は葉酸拮抗剤阻害剤（ピリメタミンおよびスルファジアジン）を使用して治療されます4、6、7。 しかし、これらの薬剤および治療に使用される第 2 選択薬は、患者に重篤な臨床副作用をもたらし、寄生虫を除去するために繰り返し投与する必要があります 6、7、8。 さらに、これらの薬剤は T. gondii の組織嚢胞 (ブラディゾイト) 型を阻害しません 6,7,8。 こうした現在の医薬品の欠点により、人間や動物の寄生虫感染症を治療できる新規化合物の発見が必要でした。

現在の研究では、TT 抽出物が細胞毒性効果を最小限に抑えながら、細胞内での T. gondii の増殖を効果的に阻害することが示されました (表 1)。 当社の IC50 値 (5.98 μg/mL) は、天然抽出物およびモロコシ由来の化合物を使用した T. gondii (RH-YFP) I 型株で報告された以前の研究の一部と一致しており、IC50 の範囲は 0.36 ～ 20.38 μg/mL でした 21。 22. しかし、我々の結果は、リーシュマニア属 15,16 で報告された in vitro 実験とは異なりました。 不一致の考えられる理由としては、抽出溶媒、TT 抽出物の組成、およびテストした原虫の種類が部分的に原因である可能性があります。

T. gondii タキゾイト増殖に対する PY の典型的な IC50 値は 0.0025 ～ 1.05 μg/mL です 28,33,34。 ただし、PY の値は高かったです。 ピリメタミンについて報告された高い IC50 値は、培養培地中での薬物の沈殿の観察に起因する可能性があり、タキゾイト細胞による吸収の低下を引き起こし、寄生虫の増殖に対する通常の効力を妨げた可能性があります。 この研究で注目すべきは、TT 抽出物の選択性指数が > 17、PY の選択性指数が > 10 であると計算されたことです。これは、TT 抽出物が、細胞毒性を引き起こすよりも、in vitro で T. gondii タキゾイトを阻害する広いスペクトルを持つことを意味します。文献で報告されている一次薬（PY）に見られる効果12。

興味深いことに、n-ヘキサンを使用した以前の研究と比較して、この現在の研究ではより多くの化合物が発見されました (Leliebre-Lara et al.15、Leliebre-Lara et al.16)。 観察された化学物質の組成の違いは、季節的および地理的パラメータに起因する可能性があります23。 また、Leliebre-Lara らによる以前の研究 15,16 では、n-ヘキサン抽出物とエタノール抽出物が分画されており、これにより、メタノール抽出物を使用した質量分析データに含まれるこれらの成分の一部が除去された可能性があります。 さらに、私たちの以前の研究では、メタノールがキノコの大きなクラスの二次代謝産物を抽出するのに最適な溶媒であることを発見しました27。

私たちの植物化学データは、トラメテス癜風化学組成に関する以前の研究の一部が、n-ヘキサンを使用して得られたTT抽出物中にエルゴステロール、5α, 8α-エピディオキシ-22E-エルゴスタ-6、22-ジエン-3β-オール、およびトラメテノール酸Bを含むことを確認しました15。 16.

さらに、これらの化合物は抗リーシュマニア活性があることが報告されています (Leliebre-Lara et al.15、Leliebre-Lara et al.16)。 したがって、抗 T. TT 抽出物で観察されるゴンディの特性は、生理活性脂質、脂肪酸、ペプチド、有機酸、ラクトン、エルゴステロール、5α、8α-エピディオキシ-22E-エルゴスタ-6、22-ジエン-3β-オール、トラメテノール酸の存在に起因する可能性があります。 B およびフェノール化合物 11、14、15、16。 ここで報告された化合物は、細胞膜を撹乱し、癌細胞の増殖停止を引き起こし、ミトコンドリア膜電位の破壊、およびラジカル生成を引き起こすことがわかっています 35,36。

我々のデータは、合成ステロール類似体（22, 26-アゾステロールおよび24, 25-(R, S) エピミノラノステロール）を使用した以前の研究によって裏付けられており、試験管内でT. gondii タキゾイトの増殖を効果的に阻害することが示されています37,38。 これらのステロールは、ステロール生合成酵素 24(25)-ステロール メチルトランスフェラーゼ (SMT) を阻害することが知られており、T. gondii、Trypanosoma cruzi、Leishmania spp37、38、39、40、 41およびランブル鞭毛虫42。 T. gondii には、これらのステロールが他の原生動物で標的とするステロール生合成経路 43 が含まれていませんが、ミトコンドリアの歪み、原形質膜の破壊、そして最終的には寄生虫の死を引き起こすことが発見されています 38。 今回の研究で JC-1 アッセイによって観察されたミトコンドリア膜破壊は、寄生虫のミトコンドリアを破壊するステロールの能力について、以下の研究者らによる以前の報告 37,38 を裏付け、効果のない酸化的リン酸化と最終的に寄生虫の死をもたらした。 重要なことに、SEM データは、TT および PY 処理が細胞内タキゾイトに形態学的欠陥を持っていることを示しました。 具体的には、タキゾイトはフック（伸長）を伴ってサイズが膨張していることが観察されました。 また、微小孔（正常なエンドサイトーシスの主要な入り口）は、その通常の三日月形状とともに、より多くの穴、深い吹き出物、しわを伴う、異常に潰れ、穿孔され、崩壊した形状を描いていることが観察されました（図4A〜H）。 これらの変化は、使用した低濃度の薬剤（TT 1.56 μg/mL および PY 0.38 μg/mL）と比較して、高濃度の薬剤（TT 50 μg/mL および PY 12.44 μg/mL）での治療でより顕著でした。 (図 4A ～ H)。 この観察は、T. gondii の増殖を阻害することが判明した特定の種類の化合物の効果に関する以前の発見と一致していました 32,37,38。 この観察により、TT 抽出物による高 ROS の誘導とタキゾイトでの MitoSOX 産生がミトコンドリア膜電位の顕著な破壊につながることが確認されました (図 1、2、3)。 さらに、これらはタキゾイトに見られるミトコンドリアの変形や構造変化を引き起こした可能性があり、さらなる実験で確認する必要がある。

他の研究でも、我々の現在の研究で特定された過酸化エルゴステロール（EP）が赤ん坊の増殖に影響を与えることが示されています44。 抗がん活性 24、抗トリパノソーマ 17、抗リーシュマニア属 15、16、および抗ウイルス特性 45、46。 EP 抗ウイルス (SARS-COVID) の作用機序は、酸化ストレス、付着、侵入、および侵入後の初期および中期段階のブロックを引き起こす細胞増殖の停止に関連していると報告されています 45,46。 また、3-β-ヒドロキシラノスタ-8, 24-ジエン-21-オイン酸 [トラメタノール酸 (TAB)] などの化合物は、H+/K+-ATPase 活性の阻害を通じてがん細胞の増殖を阻害することが報告されています 47。 これは、TAB が T. gondii H+/K+-ATPase 活性、および細胞内の T. gondii 溶解サイクル作動に重要な役割を果たす Ca2+ シグナル伝達にも影響を与えた可能性があることを示唆しています。 この推測にはさらなる研究が必要です。 さらに、文献では、ウルソール酸が MCF-7 細胞を阻害し、細胞のアポトーシスを引き起こし、がん細胞死における G1 停止につながることが報告されています 48。 TT 抽出物中のこの化合物の存在は、寄生虫の増殖停止、ROS、およびタキゾイトの死をもたらす MitoSOX 誘導にも寄与した可能性があります。

私たちの TT 抽出物フィンガープリンティング分析で発見されたもう 1 つの化合物は、抗菌、駆虫、抗真菌、除草剤、および殺虫活性があることが記録されているエンニアチン B です 49。 この複合的な作用機序は、高 ROS シグナル伝達、アポトーシス、DNA 断片化、および K+/Ca2+ チャネル調節の誘導を通じて行われます 49。

TT 抽出物のすべてのユニークな化学プロファイルと、発見されたこれらの化合物のいくつかの既知の生物活性を総合すると、TT には、特に知られている化合物において、個々の活性と組み合わせた活性を検証するためにさらに研究できる強力な化合物があると考えられています。同様の生物学的作用機序を発揮します。

要約すると、TT 抽出物の阻害活性、細胞毒性の低い効果、および化学プロファイルに関する我々の結果は、in vivo 研究のためのさらなるスクリーニングおよび化学修飾のために単離できる極性化合物が存在することを示しました。 また、T. gondii の死滅に対する TT 抽出物の考えられる作用機序は、高い ROS と MitoSOX 産生を介して、高い寄生虫ストレス、ミトコンドリア膜の脱分極、形態的変形、そして最終的にはミトコンドリアの崩壊を引き起こすものでした。

グラフに使用される生データは、対応する著者からの要求に応じて入手できます。 TT 抽出物の化学的フィンガープリンティングを補足の表 1 に示します。

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このプロジェクトは、アラバマ州立大学微生物学博士課程部門の生物科学部を通じて資金提供されました。 プログラム。 研究のために T. gondii と宿主細胞株を提供してくださったジョージア大学 (ジョージア州アテネ) の Silvia NJ Moreno 博士とそのチームに深く感謝いたします。 また、ジョナサン・カトレット氏の ASU でのインターンを支援してくださったアラバマ STEM 評議会プログラムにも感謝いたします。

おげちデスティニー・ウォケオチャ

現在の住所: 米国テネシー州ナッシュビル、メハリー医科大学歯学部 (SOD) 歯学博士号プログラム

Homa Nath Sharma と Jonathan Catrett の著者も同様に貢献しました。

アラバマ州立大学、科学、技術、工学および数学学部生物科学部、モンゴメリー、アラバマ州、36104、米国

ホマ・ナス・シャルマ、オードリー・ネイピア、ボアカイ・K・ロバートソン、ダニエル・A・アブグリ

微生物学博士号プログラム、科学、技術、工学、数学、アラバマ州立大学、モンゴメリー、アラバマ州、36104、米国

ホマ・ナス・シャルマ、オードリー・ネイピア、ボアカイ・K・ロバートソン、ダニエル・A・アブグリ

アラバマ州立大学、科学、技術、工学、数学学部、民族医学、寄生虫学、創薬研究室、アラバマ州モンゴメリー、36104、米国

ホマ・ナス・シャルマ & ダニエル・A・アブグリ

エンタープライズ州コミュニティカレッジ、エンタープライズ、アラバマ州、米国

ジョナサン・カトレット

タスキーギ大学芸術科学部化学科、タスキーギ、アラバマ州、36088、米国

おげちデスティニー・ウォケオチャ

オーバーン大学、オーバーン、アラバマ州、36849、米国科学数学カレッジ (COSAM) 化学生化学学科

メリッサ・ボルスマ

オーバーン大学研究機器施設、ハリソン薬科大学、オーバーン大学、オーバーン、アラバマ州、36849、米国

マイケル・E・ミラー

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DAA が研究のアイデアを考案しました。 DAAHNSの監督のもと、DAAとODがキノコを採取し、ODが代謝産物を抽出し、ODとCJがDAAHNSの監督のもと実験を実施し、CJとDAAがデータを処理してグラフを構築した。 MB と MEM はそれぞれ質量分析と電子顕微鏡分析を実行し、化合物の同定と寄生虫の変形の同定に技術的に貢献しました。 HNS が最初の原稿を書きました。 AN、BKR、MB、MEM はリソースを提供し、意見を提供し、提出用の原稿の改訂に貢献しました。 著者全員が最終原稿を確認し、投稿を承認しました。

ダニエル・A・アブグリへの通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

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転載と許可

Sharma、HN、Catrett、J.、Nwokeocha、OD 他。 Trametes versicolor (七面鳥の尻尾) キノコ抽出物の抗トキソプラズマ ゴンディ活性。 Sci Rep 13、8667 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41598-023-35676-6

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受信日: 2023 年 2 月 2 日

受理日: 2023 年 5 月 19 日

公開日: 2023 年 5 月 29 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-35676-6

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