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Apr 29, 2023

熱帯熱マラリア原虫におけるクロロキン耐性の進化は、推定アミノ酸トランスポーター AAT1 によって媒介される

microbiologia naturale

Nature Microbiology (2023)この記事を引用

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116 オルトメトリック

メトリクスの詳細

マラリア原虫は、消化液胞内で宿主のヘモグロビンをペプチドとアミノ酸に分解し、増殖のために原虫の細胞質に輸送します。このプロセスを中断することが、いくつかの抗マラリア薬の作用機序の中心となります。 消化液胞膜に位置するクロロキン（CQ）耐性トランスポーター pfcrt の変異は、熱帯熱マラリア原虫に CQ 耐性を与え、通常、寄生虫の適応度にも影響を与えます。 しかし、CQ 耐性の進化における他の寄生虫遺伝子座の役割は不明です。 今回我々は、集団ゲノミクス、遺伝的交配、遺伝子編集を組み合わせて、第二の液胞輸送体が抵抗性進化と代償性進化の両方において重要な役割を果たしていることを実証した。 ガンビア寄生虫の縦断的ゲノム解析により、推定アミノ酸トランスポーター (pfaat1) 変異体 S258L に対する選択の時間的特徴が明らかになり、この変異体は、pfcrt1 K76T 変異体と並行して、1984 年から 2014 年の間に頻度が 0% から 97% に増加しました。 次に、寄生虫の遺伝的交雑により、CQ 処理によって選択される pfaat1 を含む第 6 染色体量的形質遺伝子座が同定されました。 遺伝子編集により、pfaat1 S258L は CQ 耐性を増強するが、適応度は低下するが、東南アジアに一般的な多型である pfaat1 F313S は適応度を回復しながら CQ 耐性を低下させることが示された。 私たちの分析は、CQ 耐性進化における隠れた複雑さを明らかにし、pfaat1 が耐性進化の動態における地域差の根底にあり、アミノ酸と薬物輸送の両方のバランスを操作することによって寄生虫の耐性や適応度を調節している可能性を示唆しています。

微生物病原体の薬剤耐性により、制御の取り組みが複雑になります。 したがって、耐性のモニタリングと改善された治療戦略の開発には、遺伝子構造と耐性進化の複雑さを理解することが重要です。 マラリア原虫の場合、過去半世紀にわたる 5 種類の抗マラリア薬の展開により、薬剤耐性に関連するハードおよびソフトの選択的掃引が明確に特徴付けられ、耐性の世界的普及と地域起源の両方が、全世界の薬剤耐性対立遺伝子を推進しています。熱帯熱マラリア原虫の範囲1、2、3。 クロロキン（CQ）単独療法は、前世紀のマラリア根絶という野心的な計画において中心的な役割を果たしました。 CQ に対する耐性は 1957 年に東南アジア (SEA) で初めて観察され、その後 1970 年代後半からアフリカ全土に到達して広がり、この野心的な世界規模の根絶活動の終結に貢献しました4。

CQ に対する耐性は集中的に研究されています。 CQ 耐性トランスポーター遺伝子 (pfcrt、染色体 (chr.) 7) は、もともと、CQ 耐性の SEA 原虫とチンパンジー宿主で生成された CQ 感受性の南米原虫の間で行われた熱帯熱マラリア原虫の遺伝的交雑を使用して同定されました。 20 年にわたる集中研究により、薬剤耐性におけるクロロキン耐性トランスポーター (pfCRT) の機構的役割 7,8、消化液胞膜におけるその位置、および消化液胞から細胞質へ短いペプチドを輸送するその自然な機能 9 が明らかになりました。 CQ は、消化液胞内のヘモグロビン消化を妨害し、ヘモグロビン消化の有毒な副産物であるヘムが不活性なヘモゾイン結晶に変換されるのを防ぎ、寄生虫を殺します。 pfCRT に CQ 耐性変異を持つ寄生虫は、薬物作用部位から離れた食胞から CQ を輸送します 7,8。 pfcrt K76T 一塩基多型 (SNP) は、CQ 耐性の分子マーカーとして広く使用されています 10。一方、pfcrt 内の追加の変異体は、CQ11 や他のキノリン系薬剤に対する耐性のレベルを調節し 12、関連するフィットネスコストを決定します 13。 食物の液胞膜に位置する 2 番目のトランスポーターである多剤耐性トランスポーター (pfmdr1) の変異は、いくつかの遺伝的背景で CQ 耐性を調節することが示されていますが 14、CQ 耐性の進化における他の遺伝子の役割は不明のままです。 この記事では、集団ゲノミクス、実験的遺伝交配、および遺伝子編集を組み合わせて、CQ 耐性の進化に対する追加の寄生虫遺伝子座の寄与を理解しようとしました。

縦断的な集団ゲノムデータは、薬剤耐性遺伝子座の進化の説得力のある証拠を提供する可能性があります15。 我々は、薬剤圧力下での選択の兆候を調べるために、ガンビアで1984年から2014年の間に収集された600個の熱帯熱マラリア原虫ゲノムの縦断的全ゲノム配列分析を実施した（補足表1）。 遺伝子型欠損 (<10%) とマイナー対立遺伝子頻度 (>2%) を使用した濾過の後、321 の分離株 (1984 年 (134)、1990 年 (13)、2001 年 (34)、2008 年 (75)、および2014年（65））。 CQ 耐性に関連する pfcrt K76T 変異は、1984 年の 0% から 2014 年の 88% に増加しました。注目すべきことに、chr では急速な対立遺伝子頻度の変化もありました。 図6：最も強い分化は、推定上のアミノ酸トランスポーターであるpfaat1（PF3D7_0629500、chr.6）のS258L変異で見られ、同じ期間中に0％から97％まで増加しました（図1a）。 マラリア原虫の世代時間（蚊から蚊へ）を6か月と仮定すると、これらの変化は、pfaat1 S258Lでは0.18、pfcrt K76Tでは0.11の選択係数によって引き起こされました（拡張データ図1）。 pfaat1 S258L 変異と pfcrt K76T 変異は両方とも 1984 年のサンプルには存在しませんでしたが、1990 年には存在しており、これらの変異が短期間に発生して拡散したことを示唆しています。 pfaat1 と pfcrt は両方とも、ガンビアにおいて同様の時間的ハプロタイプ構造を示しました (拡張データ図 2)。 これらは、1984 年から 2014 年の間に両方の遺伝子座で高分化型ハプロタイプがほぼ完全に置き換えられたことを特徴としています。この期間中、別の既知の薬剤耐性遺伝子座 (pfdhfr) にも大きな時間的変化が観察されました (chr. 4)16 (図 1b)。 。 これらの対立遺伝子頻度の急速な変化は、pfcrt、pfaat1、および pfdhfr で発生するが、ゲノム内の他の場所では発生しないこと（図 1b）は、強力な方向性選択の明確な証拠を提供します。

a、1984 年から 2014 年までの pfaat1 S258L および pfcrt K76T をコードする SNP における時間的対立遺伝子頻度の変化。地図と拡大された西アフリカ地域はガンビアの位置を示しています。 b、hapFLKを使用して決定された熱帯熱マラリア原虫の時間的集団全体にわたるハプロタイプ分化の重要性。 P 値は、BH 法を使用した複数のテストで補正されました。 -log10 (誤検出率 (FDR) 補正 P 値) 5 での有意性しきい値は、赤い点線の水平線で示されています。 FDR 補正 P 値の上位 1% テール内の領域には遺伝子記号が付けられています。 ゲノム全体で見られる最も強いシグナルは、pfcrt、pfaat1、および pfdhfr (ピリメタミン耐性に関与する) 付近です。 c、ガンビアからサンプリングされた時間集団について、isoRelate (iR) 統計で定量化された IBD。 P 値は、BH 法を使用した複数のテストで補正されました。 -log10（FDR補正P値）5の有意性閾値は、赤い点線の水平線で示されています。 FDR 補正 P 値の上位 1% テール内の領域には遺伝子記号が付けられています。 すべてのサンプリング年の寄生虫個体群について、pfcrt および pfaat1 付近の IBD の高いピークが一貫して見られます。 1990 年のサンプル (n = 13) は c には示されていません。

ソースデータ

pfaat1 および pfcrt に対する強力な選択のさらなる証拠は、ガンビア寄生虫ゲノムにおける系統別同一性 (IBD) の分析から得られました。 pfaat1 と pfcrt の両方の周囲のゲノムで IBD の最も強いシグナルが見られました (図 1c)。 2008 年以降の pfdhfr を中心とする強いシグナルを除いて、ゲノムの他の場所では最小限の IBD が存在するため、これらのシグナルは劇的です。興味深いことに、強い IBD は、いずれかの pfaat1 が蔓延する前の 1984 年を含む、調査された 4 つの時間的サンプルすべてで観察されています。 S258L または pfcrt K76T。 しかし、その時点では、pfaat1 には単一の同義変異体 (I552I) のみが存在し、pfcrt には CQ 耐性に関連する変異変異体は存在していませんでした。 CQ は 1950 年代からアフリカ全土で第一選択の治療法でした。 これらの結果は、1984 年以前に、おそらく耐性関連遺伝子のプロモーター領域を標的とした、低レベルの CQ 耐性を与える CQ 主導の選択的掃引の可能性と一致しています。 pfaat1 は他の地球上の場所でも選択されており、これはアフリカ 17、東南アジア 18、南アメリカ (SM) 19 の以前の集団ゲノム分析から明らかです。 これらの領域の IBD を要約したプロットを拡張データの図 3 に示します。

連鎖不平衡 (LD) のパターンは、pfcrt と pfaat1 の間の機能的連鎖のさらなる証拠を提供します。 染色体間LDの最も強いゲノム全体のシグナルは、ガンビアのデータ（補足図1）とアフリカ全土のサンプルの両方で、これら2つの遺伝子座の間で見つかりました20。 pfaat1 と pfcrt の間の LD は 2001 年に最も強く、その後 2008 年と 2014 年に減衰しました（補足図 1 および 2）。これは、集中的な CQ 使用中の LD の維持と、CQ 単独療法がスルファドキシン-ピリメタミン + に置き換えられた後の LD 減衰と一致しています。 2004 年に CQ の組み合わせ、そして 2008 年にアルテミシニンの組み合わせを使用しました (参考文献 16)。

これらの遺伝子座が相互作用しているか、または同時に選択されている場合、pfcrt と pfaat1 の間で対立遺伝子頻度の相関関係が期待されます。 pfCRT のアミノ酸 72 ～ 76 の CVIET ハプロタイプの頻度は、西アフリカ (WAF) (R2 = 0.65、P = 0.0017) およびすべてのアフリカ人口全体の pfaat1 S258L の対立遺伝子頻度と有意に相関しています (R2 = 0.44、P = 0.0021)。 ）（拡張データ図4）。 この分析は、これら 2 つの遺伝子間の共進化またはエピスタシスの議論をさらに強化します。

我々は、熱帯熱マラリア原虫ゲノムからのpfaat1のハプロタイプ構造を調べた（MalariaGENリリース6（参考文献21））（図2および補足表2）。 pfaat1 S258L SNPはSEAで高頻度（58％）ですが、隣接する分岐ハプロタイプで見つかり、ガンビアおよびアフリカの他の地域のpfaat1 S258Lからの独立した起源を示唆しています（図2c、dおよび拡張データ図5）。 Hendon et al.18 も chr.1 について同じ結論に達しました。 世界中の場所からの寄生虫の IBD 分析を使用した 6 つの地域。 pfaat1 S258L の収斂進化は選択のさらなる証拠を提供し、アフリカに広がった耐性対立遺伝子がアジア起源である pfcrt および pfdhfr とは対照的です 1,2。 pfaat1 の進化は、世界の他の地域よりも東南アジアでより複雑です。 SEA にはさらに 3 つの一般的な派生アミノ酸変化があります。 pfaat1 F313S は、pfaat1 S258L (55%)、Q454E (15%)、または K541N (22%) と組み合わせて、SEA (アフリカのサンプルと比較して合計 96%、FST = 0.91) で固定近くまで広がりました。 F313S と 3 つの異なる変異の組み合わせは、F313S が最初に生じたことを示唆しています。 我々は、これらの地理的に局在するpfaat1ハプロタイプがSEAにおけるCQ耐性の進化に重要な役割を果たしており、この地域における他のキノリン系薬剤（メフロキン、キニーネ、ピペラキン、ルメファントリン）の歴史的使用における地理的差異も反映している可能性があると推測している22。

a、pfaat1 対立遺伝子の世界的分布。 b、アミノ酸 72 ～ 76 の pfcrt ハプロタイプのパーセンテージを示す比較マップ。 色付きのセグメントは、K76T 変異で変化する主要な pfcrt ハプロタイプを示しています。 pfaat1 および pfcrt 対立遺伝子頻度分析には、MalariaGEN リリース 6 のデータセットを使用しました。 この図に使用されたデータは補足表 2 に含まれています。モノクローナル感染のあるサンプル (N = 4,051) のみが含まれていました (西アフリカ (WAF) から 1,233 人、東アフリカ (EAF) から 415 人、中央アフリカ (CAF) から 170 人、994 人)東東南アジア（ESEA）からは998人、西東南アジア（WSEA）からは998人、南アジア（SA）からは37人、南アメリカ（SM）からは37人、太平洋地域（PO）からは167人）。 c、d、それぞれ pfaat1 対立遺伝子 (c) と地理的位置 (d) によって色分けされたハプロタイプの MSN。 ネットワークは、pfaat1 (25 kb 上流および下流) を中心とする 50 kb のゲノム領域から構築されました。これは、pfaat1 周囲の LD を示すゲノム領域に及びます (補足図 2)。最も高い配列カバー率を持つ合計 581 のゲノムを使用して、ネットワーク。ネットワークは 1,847 の SNP に基づいて生成されました (完全なデータセット内の少なくとも 1 つの変異体 - MalariaGEN リリース 6)。円の大きさは、表されたサンプルの数を示します (最小、1、最大、87)。同じ領域からのハプロタイプ (アジアまたはアフリカ）は一緒にクラスター化されており、pfaat1 対立遺伝子の独立した起源が示されています。

熱帯熱マラリア原虫の遺伝的交雑は、ヒト肝臓キメラマウスを用いて達成でき、研究のための大型類人猿の使用が禁止された後、マラリア遺伝学のためのこの強力なツールを復活させ、強化することができる。 我々は、CQ感受性アフリカ原虫3D7と、タイ・ミャンマー国境から最近分離されたCQ耐性原虫NHP4026との交雑の2つの独立した生物学的複製を使用した（補足表3）。 次に、CQ処理した子孫プールと対照処理した子孫プールのゲノム全体の対立遺伝子頻度を比較して、量的形質遺伝子座（QTL）を特定しました（補足表4）。 この子孫寄生虫のバルク分離分析 (BSA) 25 により、chr. が確実に同定されました。 予想どおりpfcrtを含む7遺伝子座があり、私たちのアプローチを検証しています（図3aおよび補足図3および4）。 私たちはまた、chr で重要な QTL を確認することに興味をそそられました。 複製交雑のそれぞれに6つあります（図3、補足図3および4、および拡張データ図6）。 2つの親を区別するSNPとインデルを検査することにより、各QTLの95％信頼区間（補足表5）内の遺伝子に優先順位を付けました（補足表6）。 ch. 6 QTL は 1,013 kb から 1,283 kb (270 kb) の範囲にあり、60 個の遺伝子が含まれていました。 これらのうち、54 個は血液段階で発現し、27 個には 3D7 と NHP4026 を区別する非同義変異があります。 pfaat1 は chr のピークに位置していました。 6 QTL (図 3c)。 NHP4026 は、祖先対立遺伝子を保有する 3D7 と比較して、pfaat1 に 2 つの派生非同義変異 (S258L および F313S) を保有していました。 したがって、我々は、これらの pfaat1 SNP の一方または両方が chr を駆動している可能性があると仮説を立てました。 6QTL。

a、CQ 処理前後のゲノム全体にわたる対立遺伝子頻度プロット。 同じ色の線は、技術的複製の結果を示します。 b、G'アプローチを使用して同定されたQTL。 同じ色の線は、技術的複製の結果を示します。 a および b には、4 日目に収集されたサンプルを使用した 48 時間の CQ 処理による BSA の結果が含まれています。さまざまな収集時点およびさまざまな CQ 濃度での薬物治療期間からの完全な BSA については、補足図を参照してください。 c、chrのファインマッピング。 6QTL。 95% 信頼区間 (CI) は、さまざまな収集時点 (4 日目の 48 時間 CQ 処理と 5 日目の 96 時間 CQ 処理)、プール (プール 1 およびプール 2) からのデータを含む 250 nM CQ 処理サンプルから計算されました。 ）、および薬物治療期間（48時間および96時間）。 明るいシアン色の影は、すべての QTL のマージされた CI の境界を示しています。 各行は 1 つの QTL を示します。 黒の破線は、QTL 検出の閾値 (G' = 20) を示します。 赤い垂直破線は、pfaat1 の位置を示します。

我々は、バルク 3D7 × NHP4026 F1 子孫から個々のクローンを単離し、chr で親対立遺伝子のすべての組み合わせを持つクローンを回収しました。 6およびch. 7 QTL 遺伝子座。 我々は、CQ 選択されたバルク子孫培養物 (250 nM CQ で 96 時間) と対照培養物の両方から寄生虫をクローン化しました。 これにより、155 個のクローン子孫が生成されました。100 個は CQ で選択された培養物からのもので、そのうち 62 個は遺伝的にユニークであり、55 個は未処理の対照培養物からであり、そのうち 47 個はユニークでした（図 4a）。 これら2つの子孫集団間の対立遺伝子頻度を比較したところ（図4b）、両方のchrでの有意な違いが明らかになりました。 6およびch. 7 つの QTL 領域。BSA の結果と平行。 我々は、chr.でNHP4026 CQ耐性対立遺伝子の劇的な枯渇を観察しました。 対照処理培養物における 7 QTL。CQ 選択の非存在下での CQ 耐性 pfcrt 対立遺伝子に対する強力な選択と一致します。 逆に、CQ 処理後に単離されたすべての子孫は、NHP4026 CQ 耐性 pfcrt 対立遺伝子を保有していました。 pfcrt 遺伝子座 (chr. 7) と pfaat1 遺伝子座 (chr. 6) の遺伝は、単離されたクローンにおいて密接に関連していました (図 4c)。 交雑データがエピスタシスまたは共選択と一致するかどうかをさらに調べるために、CQ 選択の非存在下でこの遺伝的交配の 5 回の独立した反復から単離された組換えクローンのより大きなサンプルを調べました。 これにより、遺伝子型 pfcrt 76T および pfaat1 258S/313F (WT) を持つクローンが大幅に過小評価されていることが明らかになりました (補足表 7、χ2 = 12.295、P = 0.0005)。 これらの結果は、自然界で観察されるこれらの遺伝子座間の強い LD と一致しており (拡張データ図 4 および補足図 1)20、2 つの遺伝子座間の機能的関係を示唆しています。 pfcrt K76Tを有する寄生虫の適応度の低下を補うpfaat1 S258L/F313Sの役割は、観察された結果の説明の可能性の1つである。

a、109 個の固有の組換え子孫の対立遺伝子遺伝。 黒と赤のブロックは、3D7 と NHP4026 の対立遺伝子を個別に示します。 灰色の縦線は、SNP の遺伝子型が特定されなかった非コア領域を示します。 左: CQ 処理の有無にかかわらず、組換え子孫プールから単離されたクローンが標識されています。 右: pfaat1 および pfcrt 対立遺伝子が標識されています。 WT は 3D7 の pfaat1 および pfcrt 対立遺伝子を示し、MUT は NHP4026 の対立遺伝子を示します。 pfaat1 と pfcrt の場所は、パネルの上部に黒い三角形を使用してマークされています。 b、96時間のCQ（250nM）処理後のプール（青色）またはコントロールプール（金色）からクローン化された固有の子孫のゲノムワイド3D7対立遺伝子頻度プロット。 c. フィッシャーの直接確率検定によって測定された、異なる染色体上の遺伝子座間の連鎖。 垂直の点線は、ボンフェローニ補正された有意性閾値 (片側) を示​​し、赤色で示された点は、pfaat1 と pfcrt に隣接する SNP 間の比較を示します。 補足表 7 は、未処理培養物から回収された寄生虫クローンの遺伝子型間の非ランダムな関連性を示しています。

次に、chr のすべての組み合わせを持つ 18 匹の寄生虫 (16 匹の子孫と両方の親のセット) の in vitro CQ 半値阻害濃度 (IC50) 値を測定しました。 6およびch. 7 QTL 対立遺伝子 (補足図 5 および補足表 8)。 NHP4026 親は、テストされた寄生虫の中で最も CQ 耐性が高かった。 以前の報告と一致して、NHP4026 pfcrt を受け継いだすべての子孫は CQ 耐性表現型を示しましたが、3D7 pfcrt を受け継いだすべての子孫は CQ 感受性でした。 寄生虫の CQ 耐性に対する pfcrt 対立遺伝子の効果は、二元配置分散分析検定に基づいて有意でした (P = 7.52 × 10−11)。 pfcrt 76T (P = 0.06) または pfcrt 76K (P = 0.19) を保有するクローンの IC50 値に対する pfaat1 遺伝子型の影響は見られませんでした。 pfaat1 258S/313F (WT) と pfcrt 76T の組み合わせでは 2 つの子孫寄生虫のみが回収されたため、この分析の検出力は限られています (図 4a および補足図 5)。遺伝子の交配。 したがって、私たちは機能解析のための同質遺伝子型寄生虫の遺伝子操作に焦点を当てました。

我々は、NHP4026 CQ耐性親のCRISPR-Cas9修飾を利用して、CQ IC50薬物応答および寄生虫適合性に対するpfaat1の変異の影響を調査しました（図5）。 NHP4026 pfaat1 は、感受性の高い 3D7 親と比較して、2 つの最も一般的な SEA 非同義変化 (S258L および F313S) を保持しています (図 2)。 これらの位置を単独および組み合わせて編集して祖先の状態に戻し、対立遺伝子の変化ごとに独立した編集から単離された3〜5個のクローンで修飾を確認しました（図5a）。 次に、親の NHP4026258L/313S、単一変異 NHP4026258L/313F、NHP4026258S/313S、および祖先対立遺伝子 NHP4026258S/313F について、ペアワイズ競合実験を使用して CQ IC50 値を決定し、適合性を測定しました。 これにより、祖先 (258S/313F) 対立遺伝子と比較して、CQ IC50 値を 1.5 倍増加させる S258L 変異の非常に重大な影響と、F313S および二重変異 (S258L/F313S) のより中程度だが重大な影響が明らかになりました (図5b)。 258L が F313S 変異と組み合わせて IC50 値の低下を示すという観察は、これらのアミノ酸変異体間のエピスタティックな相互作用を明らかにしています (図 5b)。

a、CRISPR-Cas9 遺伝子編集。 NHP4026 親から始めて、pfaat1 での SNP 状態のすべての組み合わせを生成しました。 b、薬物反応。 各ドットは、1 つの反復 IC50 測定を示します。調査した各ハプロタイプに対して 2 ～ 4 つの独立した CRISPR 編集クローンを使用しました。 生物学的複製の数は x 軸の上に示されています。 我々は、多重比較のための調整を行わずに、寄生虫系統間の IC50 値を比較するためにペアワイズ t 検定 (両側) を実施しました。 ハプロタイプは x 軸に示され、派生アミノ酸は赤色で示されます。 バーは平均値±標準誤差を示しますが、ハプロタイプ間の有意差が顕著です。 c、フィットネス。 棒は、反復された競合実験で測定された平均相対適応度 (±1 sem) を示し、点は個々の測定からの適応度を表します。 CQ の不在下で、編集された寄生虫グループごとに 3 つの独立した競合実験を実施しました。 F 統計を使用して、寄生虫系統間の適合性を比較しました。 編集された各グループのアッセイの結果は、変量効果を伴うメタ分析を使用して結合されました。 各競合実験の対立遺伝子頻度の変化については、拡張データ図 10 を参照してください。NS、有意ではありません。

ソースデータ

また、他のキノリン薬に対する反応に対する S258L および F313S 置換の影響も調べました。 結果は、キニーネ、アモジアキン、およびルメファントリンのＩＣ５０応答に対するｐｆａａｔ１置換の顕著な効果が明らかになったが、メフロキンのＩＣ５０には影響がないことが明らかになった（拡張データ図７）。 注目すべきことに、これらの IC50 値の変化は臨床耐性に関連する閾値を大幅に下回っていました。 したがって、pfaat1 の変異はさまざまな化合物に微妙に影響を及ぼしますが、これらの結果は、CQ 処理が pfcrt の変異とともに pfaat1 S258L および F313S 変異を駆動する主要な選択力であることと一致しています。

薬剤耐性をもたらす突然変異は、薬剤治療がない場合にフィットネスコストをもたらすことがよくあります。 したがって、我々は、上で作成した同じ変異体pfaat1寄生虫に対して、親NHP4026寄生虫を用いたペアワイズ競合実験を実施することにより、寄生虫の適合性を調べた。 これにより、適応度に大きな違いがあることが明らかになりました（図5c）。 ガンビアで選択的スイープを示した 258L/313F 対立遺伝子はすべての遺伝子型の中で最も適合度が低く、3D7 親が持つ祖先対立遺伝子 (258S/313F) が最も適合していましたが、258S/313S 変異はガンビアと同様の適合性を示しました。 NHP4026 親 (258L/313S)。 これらの結果は、フィットネスにおける強いエピスタティック相互作用も明らかにしました。 高いCQ IC50値を与えた258L / 313F対立遺伝子（図5b）には大きな適応性ペナルティがありました（図5c）が、SEAで優勢な258L / 313S対立遺伝子の313S変異によって適応度は部分的に回復しました。 これらの結果を総合すると、pfaat1 S258L 置換が CQ 耐性の 1.5 倍増加を裏付けており、これがガンビアでの CQ 耐性の選択的広がりを引き起こした可能性があることを示しています。 しかし、S258L は適応度が高く、SEA では寄生虫はおそらく置換 F313S によって軽減されました。 全体として、これらの結果は、pfcrt K76T 耐性対立遺伝子を保有する寄生虫の適応度に対する pfaat1 変異の大きな影響を示しています。

編集実験により、pfcrt K76T と組み合わせて祖先 pfaat1 対立遺伝子を保有するクローンが最も高い適合性を示すことが明らかになりました。 対照的に、遺伝的交配からの子孫におけるpfaat1 S258L/F313Sとpfcrt K76Tの密接な関連は、逆の関係を明らかにした。 これらの相反する結果は、CRISPR実験の場合は血液段階の寄生虫、または遺伝的交雑の場合は生活環の蚊と肝臓段階の異なる選択圧を反映しているのではないかと我々は推測している。 遺伝子編集研究は、単一の SEA 寄生虫遺伝子型 (NHP4026) を使用して実施されました。 アフリカの pfcrt CQR 対立遺伝子は SEA に由来し、共通の祖先とアミノ酸 72 ～ 76 での同一性を共有していますが、ほとんどの SEA 寄生虫 (NHP4026 を含む) は、より高い CQ IC50 値と低い CQ IC50 値に関連する pfcrt に 1 つまたは 2 つの追加の変異 (N326S および I356T) を持っています。フィットネス13,26。 ガンビアの主な pfcrt ハプロタイプは、NHP4026 とはアミノ酸 1 つが異なり、祖先由来の 326S を持っていますが、NHP4026 は 326N 変異を持っています13。 今後の研究では、アフリカの遺伝的背景に対する pfaat1 変異の影響を調べることが重要です。

pfaat1 S258L が寄生虫の表現型にどのような影響を与えるかをさらに理解するために、酵母異種発現系を使用しました。 WT pfaat1 は酵母細胞膜で発現し 27、そこでキニーネと CQ の取り込みを増加させ、キノリン系薬剤に対する感受性を与え、増殖の低下をもたらします。 CQ の取り込みは芳香族アミノ酸のトリプトファンによって競合的に阻害されることが以前に示されており、薬物およびアミノ酸の輸送における pfaat1 の役割が示唆されています 27。 したがって、我々は酵母でpfaat1 S258Lを発現させ、高レベルのCQの存在下で酵母の増殖を回復させた(拡張データ図8)。 興味深いことに、げっ歯類のマラリア原虫（Plasmodium chabaudi）における CQ 耐性の原因となる別のアミノ酸変異体（T162E）の発現も 28、酵母細胞内でのキノリン薬剤の蓄積を防ぎ、1 mM CQ の存在下で細胞の増殖を回復します 27。 これらの新しく発表された結果を総合すると、酵母における pfaat1 変異の発現は、アミノ酸とキノリンの輸送速度を変化させることによって耐性と適応度に影響を与えることが示唆されます。

AlphaFold29とI-TASSER30を用いて、3D7 PfAAT1アミノ酸配列に基づく三次元構造モデルを評価しました（拡張データ図9）。 pfCRT には 10 個の膜貫通ヘリックス 31 がありますが、pfAAT1 には 11 個あります。 これは、配列ベースの膜トポロジー予測ツール TOPCONS32 を使用して裏付けられました。 共通の pfAAT1 変異である S258L、F313S、および Q454E は膜貫通ドメインに位置し、K541L はドメイン 9 と 10 を結ぶループ内にあります。膜貫通ドメインにおけるこれらの高頻度の非同義的変化の位置は、pfCRT と強い類似点があります。これは、トランスポーター機能におけるこれらのアミノ酸の機能的役割と一致しています。

CQ 耐性の主要な決定因子として pfcrt が同定されたことは、マラリア薬剤耐性研究の状況を変える画期的な進歩であったが、CQ 耐性の進化と維持における追加の遺伝的要因の寄与は不明なままであった 26,33。 ガンビアにおける CQ 耐性の出現にわたる縦断的な集団ゲノム解析、制御された遺伝的交雑からの集団および子孫の解析、および熱帯熱マラリア原虫と酵母の両方を使用した機能検証を組み合わせることで、我々は、2 番目の遺伝子座である pfaat1 がCQ 耐性の進化において重要な役割を果たします。 このアプローチの強力な組み合わせにより、CQ 耐性の構造および pfcrt と pfaat1 間の相互作用に寄与する重要な pfaat1 変異体を調べることができました。

我々の結果は、薬剤耐性の進化におけるpfaat1の役割を示唆するいくつかのシステムからの異なる観察を統合する説得力のある証拠を提供する。 げっ歯類のマラリア原虫 P. Chabaudi では、オルソロガス遺伝子 (pcaat1) の変異 (T162E) が、実験室で進化した耐性における低レベルの CQ 耐性の決定要因であることが判明しました 28。 熱帯熱マラリア原虫のゲノムワイド関連研究では、pfaat1 の S258L 変異は、中国とミャンマーの国境沿いで収集された野外分離株の CQ 耐性と関連しており 34、一方、pfcrt K76T および pfaat1 S258L は、ゲノム全体で物理的に連結されていない染色体間で最も強い LD を示しています 20。 さらに、pfaat1 の変異は、3 つの異なる薬剤足場に対する熱帯熱マラリア原虫の耐性の in vitro 進化に関連付けられています 35。 以前の研究では、アフリカの寄生虫における、pfcrt、pfaat1、およびその他の薬剤耐性遺伝子座の周囲の領域で、最近の選択の強い兆候が特定されました16、17、36。 同様の選択の特徴はアジアと SM18,19 で見られますが、pfaat1 は極端な地理的差異を示す熱帯熱マラリア原虫遺伝子のリストで強調されています 21。

アフリカとアジアの異なる pfaat1 ハプロタイプは、これら 2 つの大陸における CQ 耐性の対照的な進化に部分的に関与している可能性があります。 pfcrt K76T と pfaat1 S258L の両方を保有する CQ 耐性寄生虫はアフリカ全土に広がりましたが、第一選択薬としての CQ が廃止された後、CQ 耐性寄生虫の有病率は多くの国で減少しました 37,38,39。 これは、薬物圧力がない場合の pfcrt K76T および pfaat1 S258L を保有する原虫の適応度が低いこと、およびアフリカにおけるマラリア原虫感染内での激しい競争と一致しています 40。

対照的に、pfcrt K76T は、多くの東南アジア諸国で依然として固定またはそれに近い状態にあります 21,41 (図 2)。 タイとミャンマーの国境では、熱帯熱マラリア原虫の第一選択治療として CQ が廃止された 1995 年以来、CQ 耐性が固定化されています 41。 我々の pfaat1 変異誘発の結果は、pfaat1 258L/313S を有する寄生虫は、pfaat1 258L/313F と比較して IC50 値が低下しているものの、適応度が上昇していることを示しています。 我々は、F313S による適応度の回復が、SEA における CQ 耐性 pfcrt K76T 対立遺伝子の保持の説明に役立つのではないかと推測しています。 F313S 変異の高頻度は、SEA42 における他のキノリンパートナー薬剤の広範な使用によって引き起こされているという対立仮説は、ルメファントリン、キニーネ、メフロキンおよびアモジアキンに対する反応に対するこの置換の影響はわずかしか見られないため、支持されません (拡張データ図) 。 7）。

pfcrt の変異は、作用部位から離れた消化液胞膜を越えた CQ の流出を可能にすることで CQ 耐性を与えます 8。 pfAAT1 は消化液胞膜にも存在し 35、おそらく芳香族アミノ酸の双方向輸送体として機能します 9,43。 キノリン薬と芳香族アミノ酸の構造的類似性を考慮すると、pfaat1 変異は、pfAAT1 が CQ および/またはアミノ酸を輸送する能力を調節する可能性があります 27,43。 pfaat1 S258L 変異は、消化液胞からの CQ の流出を増加させるか、液胞への進入速度を低下させることにより、耐性を増強する可能性があります。 この pfaat1 変異は、酵母細胞膜で異種発現された場合にキノリン薬剤の酵母細胞への侵入をブロックする 27 ことを考えると、pfaat1 S258L 変異が食胞への CQ 取り込みを減少させるという仮説を立てます (図 6)。 我々の突然変異誘発分析は、おそらく液胞からのアミノ酸輸送能力の低下により、S258L 対立遺伝子の適合コストが高いことを示しています。 興味深いことに、我々の遺伝交雑において分離するpfaat1 S258L/F313S ハプロタイプと、遺伝子編集を使用して生成されたWT pfaat1対立遺伝子との比較では、IC50値のわずかな増加のみと、適応度の限定的な低下が明らかになりました。 これは、F313S 変異がアミノ酸を輸送する本来の pfaat1 機能を回復し、それによって浸透圧ストレスと飢餓を軽減し、同時に CQ 耐性のレベルを部分的に低下させることと一致しています (図 6)。 このハプロタイプが SEA において高頻度に達していることは、第一選択薬としての CQ が廃止された後も pfcrt K76T 対立遺伝子が維持されることに寄与している可能性があります。 このモデル (図 6) は、pfAAT1 と pfCRT の役割を調べる将来の研究で検証できる作業仮説を提供します。

pfCRT (赤色) と pfAAT1 (青色) は両方とも消化液胞 (DV) 膜に位置します。 a、WT pfCRT および pfAAT1 は、それぞれペプチドと芳香族アミノ酸、および CQ を輸送します。 b、pfCRT K76T は DV から CQ をその作用部位から離れた場所に輸送し、耐性の上昇をもたらしますが、ペプチドの輸送は非効率的であり、適応度の損失につながります。 c、pfAAT1 S258L は DV への CQ の侵入を減少させ、抵抗力の上昇につながりますが、アミノ酸流動に影響を及ぼし、適応度の低下につながります。 d、pfAAT1 S258L/F313S 二重変異は、S258L 単独と比較して CQ 流入を増加させますが、アミノ酸輸送機能が回復するため、薬物治療の非存在下で IC50 値が低下し、適応度が増加します。

私たちの結果は、CQ耐性の進化における隠れた複雑さを明らかにする：薬物治療は、熱帯熱マラリア原虫の消化液胞膜に位置する追加のトランスポーター（pfAAT1）の変異に作用する全体的な選択的スイープを促進し、栄養素と薬物輸送の間のバランスを微調整し、証拠を明らかにしたエピスタシスと代償を目的としており、薬剤耐性とフィットネスの両方に影響を与えます。

この研究は、米国国立衛生研究所（NIH）の実験動物の管理と使用に関するガイドに従って実施されました。 シアトル児童研究所 (SCRI) は、施設内動物管理使用委員会によって承認された業務について、実験動物福祉局を通じて公衆衛生局から保証を受けています。 この研究で実施されたすべての研究は、SCRI 施設内動物管理使用委員会によって特別に審査され、承認されました。

プロジェクトの設計は補足図6にまとめられています。簡単に言うと、(1)集団ゲノム分析、(2)遺伝交配および量的遺伝学分析、続いて(3)機能分析を使用して、CQ耐性における追加の遺伝子座の役割を調査します。

1984年と2001年にガンビア中部（ファラフェニ）と沿岸（セレクンダ）から採取された熱帯熱マラリア原虫感染血液サンプルは、ウェルカム・トラスト・サンガー研究所で全血DNAと熱帯熱マラリア原虫ゲノムを処理し、詳細な配列決定が行われた。 2008 年と 2014 年にガンビア沿岸から収集された分離株のデータは以前に発表されていました 44,45 (補足表 1)。 配列決定の前に、選択的全ゲノム増幅 (WGA) を使用して 1984 年と 2001 年の各サンプルの全血 DNA から熱帯熱マラリア原虫のゲノムが増幅され、Illumina HiSeq プラットフォームで配列決定 (ペアエンド リード) が行われました 46。 bwa mem (http://bio-bwa.sourceforge.net/) を使用して、リードを熱帯熱マラリア原虫 3D7 参照ゲノムにマッピングしました。 マッピング ファイル (バイナリ アライメント マップ) は、Picard ツール v2.0.1 (http://broadinstitute.github.io/picard/) によってソートおよび重複排除され、SNP と indel は GATK HaplotypeCaller (https://software.broadinstitute. org/gatk/) のベストプラクティス (https://www.malariagen.net/data/pf3K-5) に従ってください。 バリアント コール フォーマット (VCF) ファイルは染色体によって生成され、bcftools (https://samtools.github.io/bcftools/bcftools.html) を使用してマージされ、vcftools (https://vcftools.sourceforge.net/) を使用してフィルタリングされました。 ろ過後、VQSLOD スコアが 2 以上、マップ品質が 30 以上で、対立遺伝子バリアントごとにサポートされるリード数が 5 以上である両対立遺伝子 SNP バリアントのみが保持されました。 マイナー対立遺伝子頻度が 2% 未満の SNP は分析から除外されました。 また、10% を超える遺伝子型が欠落しているサンプルも削除しました。 最終的なデータセットには、合計 16,385 の両対立遺伝子 SNP 遺伝子座と 321 の分離株 (1984 (134)、1990 (13)、2001 (34)、2008 (75)、および 2014 (65)) がありました。 感染の複雑さ（モノゲノムまたはポリゲノム）は、R パッケージ Biomix を使用して、マージされた VCF ファイルから近親交配係数 Fws として推定されました。 分析されたショートリード配列データは補足表1にリストされています。

感染の複雑度が 1 を超える各サンプルについて、混合対立遺伝子遺伝子型に対して最もリードが多い対立遺伝子が保持され、仮想半数体ゲノム変異データセットが作成されました。 対立遺伝子頻度は plink で計算され、時間的集団と遺伝クラスター間のペアごとの差異は、R の hierfstat パッケージで適用された Weir および Cockerham の方法を使用して Fst によって推定されました。対立遺伝子頻度差異 pFST の尤度比検定は、vcflib を使用してさらに計算されました。 組み合わせた pFST P 値については、フィッシャー法を R metaseq パッケージで実行しました。 要約 P 値は、Benjamini-Hochberg (BH) 法を使用した複数の検定で補正されました。 ガンビアでの異なる年のサンプリングからの分離株間の pfaat1 (Pf3D7_06_v3:1,213,102-1,217,313) および pfcrt (Pf3D7_07_v3:403222-406317) でのハプロタイプ共有を調べるために、遺伝子領域の分離株のすべてのペアに対して isoRelate R パッケージ 18 を使用して IBD マトリックスを抽出しました。各側面でさらに 25 kb に広がります。 isoRelate R パッケージのスクリプトに従って、R パッケージ igraph を使用して関連性ネットワークを生成しました18。 分離株が >90% の IBD を示した場合は関連性があります。

採取場所に関係なく、同じ年に採取されたサンプルを単一の母集団とみなしました。 前述したように、我々は hapFLK アプローチを使用して、タンザニアのアウトグループと比較したガンビア時間集団グループの階層的クラスタリング後のハプロタイプ分化を通じてポジティブ選択の兆候を検出しました。 hapFLK プログラムに付属の Python スクリプトを使用して各 SNP 固有の値の P 値を計算し、BH 法を使用して複数のテストに対して値を補正しました。 次に、系統による同一性に基づくペアワイズ関連性を使用して、R の IsoRelate18 パッケージによって実装されているように、各 SNP の iR 統計を導出しました。重複する iR および hapFLK -log10 P 値 >5 を持つ領域を対象領域とみなしました。

この研究には 2 つのデータセットが含まれています: (1) MalariaGEN Pf コミュニティ プロジェクト (バージョン 6.0) からの世界中の 7,000 件の熱帯熱マラリア原虫サンプルの遺伝子型 (参考文献 21)。 このデータセットには、南アメリカ (SM)、西アフリカ (WAF)、中央アフリカ (CAF)、東アフリカ (EAF)、南アジア (SA)、東南アジア西部 (WSEA)、東南アジア東部のサンプルが含まれています。アジア (ESEA) および太平洋オセアニア (PO) 地域。 (2) Cerqueira et al.15 から入手可能な全ゲノム配列データを持つ 194 のタイのサンプルも含め、それらを WSEA 母集団に統合しました。 重複した配列はサンプルの元の ID (Hypercode) に従って削除されました。 単一の寄生虫感染（宿主内多様性 FWS > 0.90）および遺伝子型決定された SNP 座位の > 50% を有するサンプルのみがさらなる分析に含まれました。 濾過後に合計 4,051 個のサンプルが残りました (補足表 2)。 非二対立遺伝子 SNP とヘテロ接合性バリアントコールはさらにデータセットから削除されました。 次に、pfaat1およびpfcrt遺伝子領域で遺伝子型データを抽出し、対立遺伝子頻度を計算しました（図2a）。

組換えの影響を最小限に抑えるために、pfaat1 遺伝子の上流 25 kb と下流 25 kb 以内に分布する 1,847 個の SNP を抽出しました。 1,847 個すべての SNP の遺伝子型が特定されたサンプル (581/4,051) のみが進化分析に使用されました。 集団構造を視覚化するために、サンプル間のペアごとの遺伝的距離を計算し、Rパッケージpopprを使用して最小スパニングネットワーク（MSN;図2bおよび拡張データ図5）を生成しました。 我々は、熱帯熱マラリア原虫とプラスモディウム・ライチェノウィのゲノム配列（PlasmoDB、バージョン46）を比較し、1,803/1,847の共通遺伝子座で遺伝子型を抽出しました。 次に、デフォルトパラメータの下で R パッケージ ape および phangorn を使用し、581 個のハプロタイプと 1,803 個の SNP を使用して、P. reichenowi をルートとする加重平均なし (UPGMA) ツリーを構築しました (拡張データ図 5)。 MSN ネットワークと算術平均ツリーによる非加重ペア グループ法を ggplot2 でプロットしました。

我々は、以前に記載されているように、ヒトキメラ肝臓およびハマダラカハマダラカを有するFRG NOD huHepマウスを使用して、寄生虫3D7とNHP4026との間の遺伝的交配を生成した（参考文献48）。 3D7 はアフリカ起源の寄生虫 51 で、数十年にわたって研究室で維持されており、CQ 感受性があります。一方、NHP4026 は、タイとミャンマーの国境にあるショクロ マラリア研究ユニットの診療所を訪れた患者からクローン化され (2007 年)、CQ 耐性があります (補足)表3)。 我々は、感染した蚊の独立したケージを使用して 3 つの組換えプールを生成しました。これらは、組換え体の独立したプールです 48。 各プール内の組換え遺伝子型の推定数は約 2,800 でした (参考文献 48)。 この研究では、AlbuMAX ベースの培地で維持された 2 つのプール (プール 1 とプール 2) を使用しました。

各組換えプールについて、寄生虫培養物を標準的な培養条件下で増殖させた 25 。 簡単に説明すると、培養物は、37 °C、pH 7.0 ～ 7.5、5% CO2、5% O2、および 90% N2 で、O+ 赤血球 (RBC) (Biochemed Services) のヘマトクリット 5% の完全培地で維持されました。 培地交換は 48 時間ごとに実行され、寄生虫血症を約 1% に保つために培養が拡大されました。 増殖後、各組換えプールを1%寄生虫血症に希釈しながら0.5mlアリコート16個に分割した。 アリコートを48ウェルプレートに維持し、CQで処理しました（補足図7）。 合計で 32 の培養がありました: 2 プール × 4 CQ 濃度 (0 (対照)、50、100 または 250 nM) × 2 薬剤持続時間 (48 時間または 96 時間) × 2 技術的複製。 薬物を適用した日を 0 日目と定義します。薬物治療の 2 日 (48 時間) 後、感染した RBC をリン酸緩衝生理食塩水で 2 回洗浄して、残留薬物を除去しました。 48 時間の CQ 処理に割り当てられたプレート (48 ウェル プレート 1) では、培養物は完全培地で維持されました。 96 時間の CQ 処理に割り当てられたプレート (48 ウェル プレート 2) では、新鮮な CQ を培地に戻し、さらに 48 時間処理しました。 合計96時間のCQ処理後、薬物を除去し、0日目、5日目、および10日目にサンプルを収集した。CQをH2Oに溶解し、不完全培地(Gibco、Life Technologies)で希釈した。 培地は48時間ごとに交換した。 寄生虫血症は、20% ギムザ染色スライドを使用してモニタリングし、寄生虫血症が 1% より高い場合は、培養物を 1% 寄生虫血症に希釈しました。 サンプルあたり約 15 μl の濃縮 RBC を収集しました。

私たちはイルミナライブラリを準備し、親と収集された96個の分離プールの両方を配列決定しました。 Qiagen DNA ミニキットを使用してゲノム DNA を抽出し、Quant-iT PicoGreen Assay (Invitrogen) で DNA を定量しました。 得られた DNA が 50 ng 未満のサンプルについては、WGA52 を実行しました。 WGA 製品は、KAPA Pure Beads (Roche Molecular Systems) を 1:1 の比率で使用して洗浄しました。 KAPA HyperPlus Kit を使用し、指示に従って 3 サイクルの PCR を行い、50 ～ 100 ng の DNA または WGA 産物を使用してシーケンシング ライブラリを調製しました。 Illumina Novaseq S4 または Hiseq X シーケンサーを使用して、すべてのライブラリーを 150 bp ペアエンドで配列決定し、サンプルあたり > 100 倍のゲノム カバレッジを取得しました。

BWA mem (http://bio-bwa.sourceforge.net/) を使用して、3D7 参照ゲノム (PlasmoDB バージョン 46) に対してシーケンシング リードをマッピングし、picard ツール v2.0.1 (http://bio-bwa.sourceforge.net/) を使用してアライメント ファイルを重複排除およびトランスフォーマットしました。 ://broadinstitute.github.io/picard/)。 BaseRecalibrator を使用して検証済みの既知のバリアント 53 のセットに基づいて基本品質スコアを再調整し、HaplotypeCaller を通じてバリアントを呼び出しました。 どちらの機能もゲノム解析ツールキット GATK v3.7 (https://software.broadinstitute.org/gatk/) からのものです。 コアゲノム領域（参考文献53で定義）に位置する変異体のみが呼び出され、さらなる分析に使用されました。

GATK の GenotypeGVCF を使用して 2 つの親からの呼び出しをマージし、参考文献で説明されているように、生のバリアント データセットに標準フィルタリングを適用しました。 54. バリアント品質スコアを再調整し、バリアント品質スコアが 1 未満の遺伝子座を削除しました。 VCF 形式の最終バリアントには、3D7 (PlasmoDB、リリース 46) を参照として snpEff v4.3 (https://pcingola.github.io/SnpEff/) を使用してアノテーションが付けられました。 フィルタリングとアノテーションの後、2 つの親で異なる SNP 遺伝子座を選択し、それらの SNP をさらなる BSA に使用しました。

参考文献に記載されている統計的手法を使用しました。 BSA の場合は 25、48、50。 分離した子孫プールからのバリアントコールは一緒にマージされました。 さらに、カバー率が 30 倍未満の SNP 遺伝子座は削除されました。 それぞれの親の遺伝子型を使用してリードをカウントし、対立遺伝子頻度を計算しました。 3D7 の対立遺伝子頻度をゲノム全体にわたってプロットし、枠サイズ 100 座位でハンペルの法則 55 に従って外れ値を除去しました。 R パッケージ QTLseqr56 を使用して BSA を実行しました。 エクストリームQTLは、G' > 20の領域として定義されました（参考文献57）。 QTL が検出されると、Li の方法 58 を使用しておよそ 95% 信頼区間を計算し、原因遺伝子の位置を特定しました。

コントロール/250 nM CQ処理の96時間後10日目に、バルク培養物からウェル当たり0.3細胞で限界希釈を介して個々の子孫をクローン化した。 寄生虫が存在する個々のウェルは qPCR (前述のとおり 49) によって決定され、標準的な培養条件下でより大きな培養物に拡張して、凍結保存とゲノム配列決定の両方に十分な材料が得られました。

クローン化された子孫は、「遺伝的交雑とBSA」セクションに記載されているように、次の変更を加えて配列決定および遺伝子型決定されました。(1) クローン化された子孫は、25倍のゲノムカバー率で配列決定されました。 (2) カバレッジがサンプルあたり 3 リードを超えた場合、SNP コールは削除されました。

ユニークな組換え子孫は、前述のパイプラインを使用してすべてのクローン子孫から同定されました49。 非クローン子孫は、ヘテロ接合性 SNP コールの数と分布に基づいて同定されました。 自家受粉した子孫は、いずれかの親に対して 90% を超える配列類似性を有することが確認されました。 複数回サンプリングされた固有の組換え子孫は、90% を超える配列類似性を持つ個々のクローン子孫のクラスターとして同定されました。 CQ 処理を行った場合と行わない場合の子孫集団におけるゲノム全体の 3D7 対立遺伝子の頻度をプロットしました。 ヒートマップは、個々の固有の組換え子孫における遺伝パターンを視覚化するために生成されました (図 4a)。 さらなるCQ IC50 v値測定のために、染色体6および染色体7のQTL領域に異なる対立遺伝子の組み合わせを持つ16個のユニークな組換え子孫を選択しました（補足図5）。

フィッシャーの直接確率検定を使用して、109 個の固有の組換え子孫のセットにわたる遺伝子座のすべての染色体間ペア間の連鎖をテストしました。 得られた P 値の -log の分布を図 4c にプロットし、座位数のボンフェローニ補正に基づいて有意性カットオフを計算しました。

３Ｄ７、ＮＨＰ４０２６、３Ｄ７×ＮＨＰ４０２６子孫の凍結保存ストックを解凍し、上記の標準培養条件下で完全培地中で増殖させた。 培養物は、48時間ごとに培地を交換して3%未満の寄生虫血症に保たれた。 親と子孫の IC50 値は、標準的な 72 時間の SYBR Green 1 蛍光アッセイによって評価されました 59。 培養物を寄生虫血症および病期について毎日評価した。 少なくとも 70% リングであった培養物を、0.15% 寄生虫血症で 10 個のウェルにわたる一連の 2 倍薬物希釈の CQ 用量反応アッセイにロードしました。 CQ 用の薬剤ストック (1 mg ml-1) を 1 回使用のアリコートとして H2O 中で調製し、使用するまで -20 °C で保存しました。 薬物の希釈液は不完全培地で調製されました。 生物学的複製は、負荷日の間に少なくとも 2 サイクルの培養で実施されました。 IC50 値は、プレートごとにロードされた 2 つの技術的複製からの 4 パラメーター曲線を使用して、GraphPad Prism 8 で計算されました。

我々は、前述のように CRISPR-Cas9 編集用のプラスミドを設計しました60。 ガイド RNA (GAAATTAAATACATAAAAGA) は、NHP4026 の pfaat1 を標的とするように設計されました。 編集（258L/313F、258S/313Sおよび258S/313F、図5a）は、ターゲットおよびシールド変異を含む相同アーム配列を通じてNHP4026に導入されました。 熱帯熱マラリア原虫はエラーを起こしやすい非相同末端結合を欠いているため、結合部位制御変異体は生成されなかった61。 寄生虫をリング段階で100μgのプラスミドDNAでトランスフェクトし、成功したトランスフェクタントを24 nM WR99210 (Jacobus Pharmaceuticalsからの贈与)で6日間処理することによって選択した。 寄生虫は約 3 週間後に回収されました。 回収した寄生虫に予想される変異が含まれているかどうかを判断するために、標的領域を増幅し（フォワードプライマー、AGTACGGTACTTTTTATATGTACAGCT、リバースプライマー、TGCATTTGGTTGTTGAGAGAAGG）、サンガーシーケンスで変異を確認しました。 我々は、成功したトランスフェクション実験から寄生虫をクローン化しました。(異なるトランスフェクション実験からの) 独立して編集された寄生虫が、pfaat1 遺伝子型ごとに回収されました。 編集された寄生虫のゲノム配列が決定され、ゲノム内の他の場所にあるオフターゲット編集が特定されました。 元の NHP4026 と CRISPR で編集された寄生虫の間で、ターゲット変異とシールド変異以外の SNP またはインデルの変化は見つかりませんでした。

CQ、アモジアキン、ルメファントリン、メフロキンおよびキニーネの寄生虫 IC50 値は、CRISPR-Cas9 修飾系統あたり 2 ～ 4 個のクローンと、クローン子孫について上記したように複数の負荷日にわたって NHP4026 について測定されました。ただし、各プレートには 2 つの NHP4026 技術的複製が含まれていました。コントロールとして。 各ロード日内の遺伝子型のこの複製により、ロード日によるバッチ効果の検出が可能になりました。

分散分析を使用して、バッチ効果を説明し、すべての遺伝子型グループ間の IC50 値の差、および試験した各薬物の CRISPR-Cas9 修飾系統と NHP4026 間の各コントラストをテストしました 62。 説明変数として負荷日（バッチ）と遺伝子型を使用した線形モデルを利用して、CRISPRCas9修飾の影響を視覚化するためのバッチ補正されたIC50値を生成しました（図5bおよび拡張データ図7）。

寄生虫は、密度勾配を使用して後期シゾントに同期しました63。 後期シゾントの最上層を除去し、ロズウェルパーク記念研究所（RPMI）培地で2回洗浄した。 同調培養物を５％ヘマトクリットの完全培地５ｍｌに懸濁し、穏やかに振盪しながら一晩再侵入させた。 寄生虫血症および寄生虫の段階は、フローサイトメトリーを使用して定量化されました。 簡単に言うと、80μlの培養物およびRBC対照をSYBR Green IおよびSYTO 61で染色し、Guava easyCyte HT (Luminex)で測定した。 相対的な寄生虫血症と病期を決定するために、合計 50,000 件のイベントが記録されました。 寄生虫の 80% がリングステージにいたとき、直接対決の競争実験が設定されました 64。 96 ウェル プレート (ウェルあたり 200 μl) 内で、CRISPR-Cas9 編集寄生虫と NHP4026 を 1:1 の比率で 1% の寄生虫血症で競合アッセイを設定し (ウェルあたり 200 μl)、30 日間維持しました。 各アッセイには、3 つの生物学的複製 (異なる CRISPR-Cas9 編集実験からの 3 つの独立したクローン) と 2 つの技術的複製 (2 つの培養ウェル) が含まれていました。 2日ごとに、ギムザ染色スライドを使用した顕微鏡検査によって寄生虫血症を評価し、サンプルを採取して-80℃で保存し、培養物を新鮮なRBCと培地で1％寄生虫血症に希釈しました。 各競合における寄生虫の割合（拡張データ図 10）は、pfaat1 の CRISPR-Cas9 編集領域を標的とするプライマーを使用した rhAmp SNP アッセイ（Integrated DNA Technologies）を使用して測定されました。

対立遺伝子比の自然対数（freq（対立遺伝子編集寄生虫）/freq（NHP4026））と時間（48時間の寄生虫の無性周期で測定）との間の線形モデルをフィッティングすることにより、選択係数（s）を測定しました。 線形モデルの傾きは、各突然変異の駆動力の尺度を提供します65。 異なる pfaat1 対立遺伝子を持つ寄生虫の相対的な適応度を比較するために、NHP4026 の適応度を 1 に正規化し、傾き + 1 を使用して CRISPR-Cas9 編集寄生虫の適応度を定量化しました（図 5c）。

pfAAT1 発現酵母を生成するために、pfaat1 コード配列を保持するプラスミドを、前述のように酵母 Saccharomyces cerevisiae (BY4743) に形質転換しました 27。 空のベクター、WT pfAAT1 または S258L 変異体 pfAAT1 を保有する株の倍加時間 (h) を測定しました。 コントロールまたは 1 mM CQ を使用した 2 つの培養条件下で倍加時間を測定しました。 各アッセイについて 3 つの独立した実験を実行しました。

pfAAT1 の三次元相同性モデルは、AlphaFold29,66 および I-TASSER30,67,68 を使用して予測され、PyMol ソフトウェア (v2.3.0; Schrödinger, LLC) で分析されました。 一次配列レベルでは、比較のためにTOPCONS32を使用して膜貫通ヘリックストポロジーを予測しました。 計算によって予測された構造と膜トポロジーに基づいて、タンパク質の膜貫通トポロジーの漫画版をプロットしました (拡張データ図 9)。 AlphaFold はこの N 末端ストレッチに低い信頼性を割り当てるため、モデルはおそらく膜の外側に位置するアミノ末端残基 1 ～ 166 を除外するために切り詰められました。 さらに、3D モデルと TOPCONS の両方に従って、対象の変異は膜貫通ヘリックスにのみマッピングされます。 I-TASSER は、AlphaFold の低信頼領域 1 ～ 166 および 475 ～ 516 の変動が最も大きい、AlphaFold と同様のトポロジーを持つモデルを生成しました。 上位 5 つの I-TASSER モデルは、PDBeFold サーバー (http://www.ebi.ac.uk/msd) を使用して、440 個の整列残基のうち 303 ～ 327 にわたって 2.4 ～ 2.8 Å の二乗平均平方根偏差範囲で AlphaFold モデルに重ねられます。 -srv/ssm)。 4 つの共通 SNP (S258L、F313S、Q454E、および K541L) は、相同性モデル間で密接に重なっています。 PyMol の突然変異誘発機能を使用して、さまざまな突然変異がタンパク質の安定性に及ぼす影響を評価しました。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Portfolio Reporting Summary を参照してください。

すべての生の配列決定データは、国立バイオテクノロジー情報センター配列読み取りアーカイブ (SRA、https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra) または欧州ヌクレオチド アーカイブ (ENA) に提出されており、補足表にアクセッション番号が記載されています。 1 および 2。その他すべてのデータは、本文または補足資料で入手できます。 ソースデータはこのペーパーに付属しています。

分析に使用されたコードと分析されたデータは、次のリンクから GitHub で入手できます: https://github.com/emilyli0325/CQ.AAT1.git (XL)、https://github.com/MPB-mrcg?tab=リポジトリ (AA-N.) および https://github.com/kbuttons/CQ.AAT1.progeny.git (KAB-S.)。

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我々は、B. グリーンウッド氏と T. コラー氏の初期の所長の下での研究を含め、サンプルがアーカイブされた研究に携わったガンビアの MRC ユニットの過去および現在のスタッフおよび客員研究員に感謝します。 テキサス生物医学研究所での研究は、研究施設改善プログラム助成金 C06 RR013556 の支援を受けて建設された施設で行われました。 Shoklo マラリア研究ユニットは、英国ウェルカム トラストの支援を受けるマヒドン オックスフォード大学研究ユニットの一部です。 ウェルカム トラスト サンガー研究所のサンプル ロジスティクス、シーケンス、情報学施設のスタッフの貢献に感謝します。 サンアントニオのテキサス大学健康科学センターの構造生物学コアは、研究担当副学長室、グリーヘイ小児がん研究所、およびメイズがんセンターの創薬および構造生物学共有リソースによって支援される施設内研究コアの一部です。 (NIH 認可 P30 CA054174)。 資金提供: NIH 助成金 P01 12072248 (MTF)。 NIH 助成金 R37 AI048071 (TJCA); MRC キャリア開発フェローシップ MC_EX_MR/K02440X/1 (AA-N.); MRC マラリア プログラム助成金 MC_EX_MR/J002364/1 (UDA); 欧州研究評議会助成金 AdG-2011-294428 (DC および AA-N.)。 MRC 許可 MR/S009760/1 (DC); ウェルカム トラスト (206194 および 204911) およびビル & メリンダ ゲイツ財団 (OPP1204628 および INV-001927) (DK)。 バイオテクノロジーおよび生物科学研究評議会助成金 BB/M022161/1 (SVA); およびウェルカム トラスト (認可番号 220221) (FHN)。 オープンアクセスを目的として、著者は、この投稿から生じた著者が承認した原稿バージョンに CC BY 公共著作権ライセンスを適用しています。

これらの著者は同様に貢献しました: Alfred Amambua-Ngwa、Katrina A. Button-Simons、Xue Li、Sudhir Kumar、Katelyn Vendrely Brenneman。

ガンビア、バンジュールのロンドン・スクール・オブ・ハイジーン・アンド・トロピカル・メディスンのMRCユニット・ガンビア

アルフレッド・アマンブア・ングワ & ウンベルト・ダレッサンドロ

エックグローバルヘルス研究所、ノートルダム大学生物科学部、ノートルダム、インディアナ州、米国

カトリーナ・A・ボタン＝シモンズ、ケイトリン・ヴェンドリー・ブレネマン、リサ・A・チェックリー、ダグラス・A・シュー、ヘイリ​​ー・ダルホフ、ジェームズ・K・ラーバレスティア、マイケル・T・ファーディグ

疾病介入および予防プログラム、テキサス生物医学研究所、米国テキサス州サンアントニオ

シュエ・リー、マルコ・フェラーリ、マリーナ・マクデュー＝ホワイト、アン・レイエス、エリザベス・デルガド、ティモシー・J・C・アンダーソン

世界感染症研究センター、シアトル児童研究所、米国ワシントン州シアトル

スディール・クマール、メセレト・T・ハイル、ステファン・HI・カッペ、アシュリー・M・ヴォーン

ノッティンガム大学生命科学部、ノッティンガム、英国

サラ・M・ティンダル＆サイモン・V・エイブリー

ウェルカム・サンガー研究所、英国ヒンクストン

ロベルト・アマト、リチャード・D・ピアソン、ドミニク・クウィアトコウスキー

米国テキサス州アントニオ、サンアントニオのテキサス大学健康科学センター、生化学および構造生物学部

アレクサンダー・B・テイラー

Shoklo マラリア研究ユニット、マヒドン・オックスフォード熱帯医学研究ユニット、マヒドン大学、メーソート、タイ

フランソワ・H・ノステン

オックスフォード大学ナフィールド医学部、熱帯医学および国際保健センター、オックスフォード、英国

フランソワ・H・ノステン

宿主病原体相互作用プログラム、テキサス生物医学研究所、米国テキサス州サンアントニオ

イアン・H・チーズマン

ワシントン大学小児科（米国ワシントン州シアトル）

ステファン・HI・カッペ＆アシュリー・M・ヴォーン

ワシントン大学グローバルヘルス学部、シアトル、ワシントン州、米国

ステファン HI ケープ

ロンドン衛生熱帯医学大学院感染生物学科、ロンドン、英国

デビッド・J・コンウェイ

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AA-N.、KAB-S.、XL、SK、KVB も同様にこの作業に貢献しました。 概念化: MTF、TJCA、IHC、AMV、AA-N。 および DJC 方法論: AMV、SK、SVA、および ABT 調査: AA-N.、UD、DK、DJC、RA、RDP、KAB-S.、KVB、MM-W.、MTH、LAC、HD、JKL、AR、 ED、SK、DAS、SMT、MF、ABT、および TJCA 分析: XL、KAB-S。 そしてAA-N。 視覚化: XL、KAB-S。 そしてAA-N。 資金獲得：MTF、TJCA、DJC、AA-N.、DK、SVA、FHN プロジェクト管理：MF、DK、AA-N.、DJC、SVA 監督：MF、AMV、TJCA、IHC、SHIK、SVA、DK、 DJC 執筆—原案: KVB、TJCA、KAB-S。 XL ライティング - レビューと編集: MTF、AMV、IHC、SK、AA-N.、DJC、DK、UD、RDP、SHIK、FHN、ABT、および TJCA

Ashley M. Vaughan、Michael T. Ferdig、Timothy JC Anderson との通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

Nature Microbiology は、この研究の査読に貢献してくれた Liwang Cui 氏、Carol Sibley 氏、およびその他の匿名の査読者に感謝します。 査読者レポートが利用可能です。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

pは、図1aに示されている変異対立遺伝子（pfaat1 S258Lまたはpfcrt K76T）の頻度であり、q（= 1-p）は野生型（3D7）対立遺伝子の推定頻度です。 X 軸は寄生虫の世代を示します (サンプル収集年でラベル付けされています)。 ガンビアでは CQ 単独療法が 2004 年に中止されたため、我々は 1990 年と 2001 年の対立遺伝子頻度に基づいて選択係数 (s) を推定しました。s は、寄生虫の世代ごとの相対成長の変化 (つまり、蚊と蚊の両方の完全なライフサイクルの期間) を示します。人間の宿主）。 この計算は、年間 2、4、または 6 世代の推定に基づいています。

ハプロタイプ関係は、各遺伝子の両側の 25 kb を含むゲノム セグメントの系統別同一性に基づいていました (方法を参照)。 線で結ばれたハプロタイプは >90% の IBD を示します。 各点は、サンプリングされた年を表す点の色で分離株を表します。 四角い点は複雑な感染を表し、円はモノクローナルを表します。 MOI、感染多重度。

パネルA～Hは、異なる地理的地域からの寄生虫のゲノム全体にプロットされたIBDペアの割合を示しています(各パネルの左上にマーク)。 ゲノムの >90% が IBD であるサンプルの場合、最も高い遺伝子型率を持つ代表的なサンプルを 1 つだけ選択し、IBD 分析に使用しました。 サンプル番号は各パネルに表示されます。 染色体の境界は灰色の垂直破線で示されます。 pfaat1 と pfcrt の位置は、各パネルの上部に赤い矢印で示されています。 chr 10 ピーク (西アフリカ、A) には、ハロファントリン、メフロキン、ルメファントリンに対する感受性の低下に関連する pfmspdbl2 が含まれています69。 chr 8 ピーク (東アフリカおよびアジア (CH)) にはジヒドロプテロ酸シンターゼ (スルファドキシン耐性) が含まれており 70、chr 12 ピーク (DF) には葉酸拮抗薬の代償遺伝子座である GTP シクロヒドロラーゼ I が含まれています 71。 Amambua-Ngwa et al.17、Hendon et al.18、Carrasquilla et al.19 による分析も参照してください。

A. アフリカ諸国における pfcrt 対立遺伝子の分布。 B. アフリカ諸国における pfaat1 対立遺伝子の分布。 C. pfcrt (CVIET) と pfaat1 (S258L) の間の対立遺伝子頻度の相関。 pfcrt のアミノ酸 72 ～ 76 の CVIET ハプロタイプの頻度は、西アフリカ (R2 = 0.65、p = 0.0017、赤い破線) またはアフリカ全人口全体の pfaat1 S258L の対立遺伝子頻度と有意に相関しています (R2 = 0.44、p = 0.0021）。 ポイント サイズはサンプル番号を示し、色はサンプリング位置を示します。 t 検定を使用して、ピアソンの r 統計量がゼロから大きく異なるかどうかを確認しました。

この木には、Plasmodium reichenowi が根付いていました (木には示されていません)。 WAF: 西アフリカ、EAF: 東アフリカ、CAF: 中央アフリカ、SM: 南アメリカ、ESEA: 東南東 (SE) アジア、SA: 南アジア、WSEA: 西東南アジア、PO: 太平洋地域。

ソースデータ

０日目に、０（対照）、５０、１００、または２５０ｎＭでＣＱ処理をプールに適用した。 水色の網掛けで示すように、CQ は 2 日目 (48 時間処理) または 4 日目 (96 時間処理) に除去されました。 48 時間の CQ 処理では、サンプルは 0、4、7 日目に収集されました。 一方、96 時間の CQ 処理では、サンプルは 0、5、10 日目に収集されました。実線または破線は、さまざまな技術的反復の結果です。 CQ 処理プールにおける 3D7 対立遺伝子頻度は、chr.6 と chr.7 の両方の QTL 領域で減少します。 chr.14 QTL 領域では、薬物治療後に対立遺伝子頻度はまったくまたはほとんど変化を示さず、この QTL が薬物治療と無関係であることを示唆しています。

CRISPR/Cas9 遺伝子編集により、キニーネ (QN)、ルメファントリン (LUM)、アモジアキン (AMD) では IC50 にわずかな差が生じましたが、メフロキン (MQ) では大きな変化はありませんでした。 ただし、すべての IC50 は、これらの薬剤の臨床的意義のレベル (臨床閾値: QN = 600 nM72、MQ = 30 nM72、AMD = 60 nM72) を下回るか、in vitro 範囲 (0 ～ 150 nM) の下限にありました。 LUM73の場合。 生物学的複製の数が x 軸の上に示されています。 P 値は有意水準を示し、二元配置分散分析に基づいています。 データは平均値 +/- SEM として表示されます。

ソースデータ

酵母の倍加時間は、指数関数的増殖の直線部分から計算されました。 データは、3つの独立した実験からの平均値±SEM、および有意性として示され、二元配置分散分析の多重比較(ターキー補正あり)に従って計算されました。 野生型 pfaat1 (WT) を発現する酵母細胞の増殖は、CQ 処理 (実験では 1 mM CQ) によって重大な影響を受けますが、pfaat1 S258L を発現する酵母細胞では回復します。 発表された結果は、AAT1 が酵母細​​胞膜で発現される 27 のに対し、pfAAT1 は消化液胞膜に局在し 43、細胞膜にも存在する可能性がある 35 ことを示しています。

(A) PfAAT1 の AlphaFold モデル (左)、PfAAT1 の代表的な I-TASSER モデル (中央)、AlphaFold モデル (青緑色) と I-TASSER モデル (灰色、右) の構造の重ね合わせ。 TOPCONS 膜貫通 (TM) ヘリックス トポロジー予測は、濃青色のモデルにマッピングされています (左、中央)。 AlphaFold および I-TASSER モデルは、440 残基中 327 残基にわたって 2.5 Å の RMSD と一致します。 構造予測の信頼性が低いため、アミノ末端残基 1 ～ 166 はすべてのモデルから除外されました。 (B) AlphaFold モデルを使用して予測された PfAAT1 3-D 構造上の変異の詳細図。 右図は、図を見下ろした軸を中心に 45 度回転し、その後水平軸を中心に 90 度回転することによって、左図と関連付けられています。 空間充填モデルとして示されている 4 つの SNP はすべて、モデルの片側の平面内に膜に垂直に配置されています。 S258L (ヘリックス 3) と F313S (ヘリックス 5) は、ヘリックス 8 を挟んで向かい合って配置されています。 機能解析から明らかな PfAAT1 S258L と F313S SNP 間のエピスタティック相互作用を考慮すると、F313S の嵩高い疎水性フェニルアラニンをより小さい極性セリンに置換することで、ヘリックス 3、5、および 8 を含む膜貫通領域の破壊が補償される可能性があります。予測されたアミノ酸輸送活性の部分的な回復を可能にする可能性があります。 Q454E は TM 表面近くのヘリックス 8 に位置し、K541N はヘリックス 9 と 10 を接続するループ内に位置します。(C) 3D 構造を使用して推定された PfAAT1 のトポロジー。 11 個の膜貫通 (TM) ヘリックスがあります。 変異のうち 3 つは TM ヘリックスに位置し、K541N はヘリックス 9 と 10 を接続するループに位置します。配色はパネル B の図式と一致します。青い三角形は、構造から除外されたアミノ末端残基 1 ～ 166 を示します。予測。

各遺伝子型に対して 3 つの独立した CRISPR/Cas9 編集クローンを使用し、各競合実験に対して 2 つの技術的複製を使用しました (平均値がプロットされています)。

補足図。 1～7。

補足表 1.pfaat1 コドン 258 および pfcrt コドン 76 のガンビアサンプルのアクセッション番号、サンプル ID、および対立遺伝子。 補足表 2。pfaat1 対立遺伝子と進化の研究で使用されたサンプル。 補足表 3。親寄生虫の遺伝子型の概要。 補足表 4. クロスサンプルの情報とアクセッション番号。 補足表 5.QTL 領域内の遺伝子。 補足表6。chr.6 QTL領域内のSNPとインデル。 補足表 7。CQ 選択なしの遺伝的交雑 3D7 × NHP4026 からの固有の組換え子孫。 補足表 8. 選択した子孫の CQ IC50 データ。

ガンビアにおけるコドン pfaat1 258 および pfcrt 76 の年間サンプリング当たりの対立遺伝子数と変異体の割合。CRISPR/Cas9 編集寄生虫の IC50 データ。 CRISPR/Cas9 編集寄生虫のアモジアキン、メフロキン、ルメファントリン、キニーネの IC50 データ。 細胞倍加時間 (h)、3 回測定。

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転載と許可

Amambua-Ngwa, A.、Button-Simons, KA、Li, X. 他熱帯熱マラリア原虫におけるクロロキン耐性の進化は、推定上のアミノ酸トランスポーター AAT1 によって媒介されます。 ナット マイクロバイオル (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41564-023-01377-z

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受信日: 2022 年 7 月 26 日

受理日: 2023 年 3 月 29 日

公開日: 2023 年 5 月 11 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41564-023-01377-z

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