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Sep 07, 2023

韓国の反芻動物からのウシ連鎖球菌/馬目連鎖球菌複合体 (SBSEC) に感染する 2 つの溶解性バクテリオファージの特性評価

Rapporti scientifici Volume 13,

Scientific Reports volume 13、記事番号: 9110 (2023) この記事を引用

メトリクスの詳細

ボビス連鎖球菌/馬連菌（SBSEC）は、亜急性第一胃アシドーシスを引き起こす最も重要な乳酸産生ルーメン細菌の 1 つです。 第一胃細菌の重要性にもかかわらず、第一胃内で SBSEC に感染できる溶解性バクテリオファージ (ファージ) の特徴はほとんど解明されていません。 したがって、我々は、新たに報告された S. ruminicola を含むさまざまな SBSEC 種に感染する 2 つの溶解性ファージ (vB_SbRt-pBovineB21 および vB_SbRt-pBovineS21 と指定) の生物学的およびゲノム的特徴について説明します。 単離されたSBSECファージは形態学的にポドウイルス科に類似しており、ラクトコッカスやラクトバチルスなど他の属の乳酸産生細菌に感染することができた。 さらに、それらは高い熱安定性および pH 安定性を示し、これらの特性は、亜急性ルーメン アシドーシスで見られる低 pH などのルーメン環境への強い適応を誘導します。 ゲノムに基づいた系統発生により、両方のファージがフィスケッティ ウイルスの連鎖球菌ファージ C1 に関連していることが明らかになりました。 しかし、それらはファージ C1 よりもヌクレオチドの類似性が低く、異なるゲノム配列を持っていました。 S. ruminicola を使用してファージの溶菌活性を評価したところ、ファージは浮遊細菌の増殖を効率的に阻害しました。 さらに、両方のファージは、さまざまな SBSEC 株および他の乳酸産生細菌の細菌バイオフィルムを in vitro で防ぐことができました。 したがって、新たに単離された 2 つの SBSEC ファージは、新しいフィスケッティウイルスのメンバーとして分類され、第一胃 SBSEC 細菌およびそのバイオフィルムに対する潜在的な生物防除剤と考えられる可能性があります。

ボビス連鎖球菌/馬連鎖球菌複合体 (SBSEC) は、ヒトおよび家畜 (ウシ、ヤギ、馬など) の消化管に存在する共生細菌群です1。 SBSEC グループは、Streptococcus (S.) equinus (S. bovis と同義)、S. gallolyticus subsp. などの種の表現型の特徴に基づいて分類されています。 ガロイティクス、S. gallolyticus subsp. パストゥリアヌス、S. gallolyticus subsp. マケドニクス、Ｓ．インファンタリウス亜種。 インファンタリウス、S. ルテティエンシス、および S. alactolyticus2。 最近、韓国の反芻動物から分離された新種 S. ruminicola が、このグループの株の中で異なる生物学的特性を持つ新しいメンバーとして提案されました 3。 SBSEC の特定の（亜）種は、感染性心内膜炎や結腸直腸癌による菌血症などの臨床感染症を引き起こしています。 これらは、反芻動物の亜急性ルーメンアシドーシスなどの動物の代謝障害にも関与しており 4,5,6 、潜在的な病原体としてのこのグループの重要性が示されています。

バクテリオファージ (ファージ) は、2 つの複製ライフサイクル (溶菌性と溶原性) を通じて自然に細菌に感染し、宿主ターゲティングの特異性が高く、マイクロバイオーム コミュニティの混乱を回避します7。 ファージのユニークな属性により、ファージはいくつかの病原性細菌を選択的に制御する潜在的な抗菌剤となります。 細胞外ポリマー物質からなる細菌バイオフィルムは、抗生物質、熱、酸性条件に対して非常に耐性があり、その結果、非生物および生物群集で抗菌剤耐性細菌が増加します8。 ファージは、バイオフィルムの形成を制御し、浮遊細胞の表面にある既存のバイオフィルムに侵入することが報告されています9。 ファージは第一胃内容物 1 グラムあたり約 108 個の粒子集団で第一胃内で発見されていますが 10、厳密な培養環境下でのほとんどのファージの生物学的特性に関してはほとんど知られていません。 現在までに、14 個のファージが連鎖球菌属に感染しています。 これらは国際ウイルス分類委員会 (ICTV; https://ictv.global/taxonomy) によって分類学的に承認されており、連鎖球菌ファージを含む完全に配列決定された約 800 のゲノムが GenBank データベースで利用可能です。 ただし、SBSEC に感染するファージに関する研究は、他の連鎖球菌属の研究に比べて比較的少ないです。 第一胃細菌の重要性にもかかわらず。 現在、Joint Genome Institute Genome Portal で利用できるのは、シフォウイルス科の形態型を持つ SBSEC ファージ分離株 ϕSb01 のゲノム 1 つだけです11。

それにもかかわらず、SBSEC ファージは、ミオウイルス科のルミノコッカス アルバスやバクテロイデス属などのルーメン細菌に感染するウイルスの中でよく研究されているファージの 1 つです。 ポドウイルス科の１３． さらに、いくつかの溶解性または溶原性 SBSEC ファージ分離株は、形態学的および遺伝学的に特徴づけられています 14、15、16、17。 さらに、配列決定された SBSEC ゲノムからのプロファージベースのエンドリシンをルーメン微生物叢の制御に応用できる可能性が報告されています 18。 しかし、私たちの知る限り、ポドウイルス科の形態型を持つ SBSEC ファージはまだ報告されていません。 したがって、我々は、新たに報告されたS. ruminicolaおよびバイオテクノロジー応用の強い可能性を秘めた乳酸産生細菌の他の属（例えば、LactococcusおよびLactobacillus）を含む様々なルーメンSBSEC細菌に感染できる2つの溶解性ファージを報告する。 両方の SBSEC ファージ (vB_SbRt-pBovineB21 および vB_SbRt-pBovineS21 と指定) の生物学的およびゲノム的特徴、および細菌バイオフィルムを制御する能力を調べました。 これは、我々の知る限り、ポドウイルス科の形態型を有するファージの最初の報告であり、このファージは、反芻動物の第一胃内で見出されるSBSEC種および他の乳酸産生細菌に感染する。

この研究では合計 2 つの SBSEC ファージが単離され、これらは vB_SbRt-pBovineB21 および vB_SbRt-pBovineS21 と命名されました。 SBSEC ファージ vB_SbRt-pBovineB21 は、Hanwoo 農場 (韓国、忠清南道) から収集された糞便サンプルから単離され、vB_SbRt-pBovineS21 は、下水処理場 (韓国、大田) から得られた下水サンプルから単離されました。 二層寒天法を使用すると、韓国型培養コレクション (KCTC) の S. ルミニコラ KCTC 43306 株を宿主として使用し、単離された両方のファージが芝生上に透明なプラークを生成することができました。 透過型電子顕微鏡 (TEM) 分析により、ファージ vB_SbRt-pBovineB21 および vB_SbRt-pBovineS21 は、それぞれ直径 49.2 nm および 46.2 nm の正二十面体頭部を有することが明らかになりました。 また、それぞれ 13.3 nm と 12.5 nm の短い非収縮尾も示しました (図 1)。 したがって、両方のファージは形態学的にポドウイルス科のメンバーとして分類されました。 単離されたファージの宿主範囲分析により、S. quinus 株の中で、Bos taurus (15.4%) および Bos taurus coreanae (35.3%) からの分離株の溶解率が低いことが明らかになりました。 しかし、S. ruminicola (100%)、S. quinus (64.3 ～ 71.4%)、および S. lutetiensis (100%) を含む、Capra aegagrus hircus からのほとんどの分離株は、これらのファージによって溶解されました (表 1)。 SBSEC および S. agalactiae の 9 種類の菌株では溶菌は観察されなかった。 注目すべきことに、両方のファージは、他の属であるラクトバチルス属のすべてのタイプの菌株に感染することができた。 およびＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ． この研究ではラクティスを使用しました。

単離されたSBSECファージの透過型電子顕微鏡写真。 (a) 正二十面体の頭部 (49.2 nm) と短い非収縮尾部 (13.3 nm) を示す vB_SbRt-pBovineB21 ファージの TEM 画像は黒い矢印で示されています。 (b) 正二十面体頭部 (46.2 nm) と短い非収縮尾部 (12.5 nm) を示す vB_SbRt-pBovineS21 ファージの TEM 画像は黒い矢印で示されています。 スケールバーは50nmです。

遊離SBSECファージの80％以上が約15分以内に減少し、ファージが宿主株に効率的に吸着されたことが示されました（図2a、b）。 潜伏時間とバースト サイズは、最適感染多重度 (MOI) 0.0001 での S. ルミニコラ KCTC 43306 に対する単離ファージの 1 段階増殖曲線を使用して決定されました。 図2cに示すように、ファージvB_SbRt-pBovineB21の潜伏時間とバーストサイズは、それぞれ約20分と367.5 PFU/感染細胞でした。 さらに、ファージvB_SbRt-pBovineS21は、潜伏時間とバーストサイズがそれぞれ約20分、感染細胞あたり198.3 PFUでした（図2d）。

単離されたSBSECファージの吸着速度とワンステップ増殖曲線。 ファージ vB_SbRt-pBovineB21 (a) および vB_SbRt-pBovineS21 (b) の吸着率は、15 分で 80% 未満に減少しました。 ファージ vB_SbRt-pBovineB21 (c) および vB_SbRt-pBovineS21 (d) のワンステップ増殖曲線は、それぞれ 20 分の潜伏時間と 367.5 および 198.3 PFU/mL のバースト サイズを示します。 すべての実験において、S. ruminicola KCTC 43,306 を使用して 3 回のアッセイを独立して実施しました。 エラーバーは平均値の標準誤差を示します。

単離された SBSEC ファージの安定性をさまざまな温度および pH 値で測定しました。 熱安定性の結果に関して、ファージ vB_SbRt-pBovineB21 は 4、16、25、37、45、および 56 °C で 3 時間では比較的安定していましたが、80 °C で 3 時間インキュベートした後は完全に不活化されました。 ファージ vB_SbRt-pBovineS21 は 4、16、25、37、および 45 °C では比較的安定していましたが、56 および 80 °C で 3 時間インキュベートした後は完全に不活化されました（図 3a）。pH 安定性の結果は、両方のファージがファージはpH 3〜12の範囲で生存し、pH 2では完全に不活化されたため、どのファージも強酸性およびアルカリ性の環境では生き残ることができないことを示唆しています（図3b）。

異なる熱条件および pH 条件下での単離された SBSEC ファージの安定性。 (a) 4、16、25、37、45、56、および 80 °C での両方の単離されたファージの熱安定性。 (b) pH 2、3、4、4.6、5、6、7、8、9、10、11、および 12 での単離されたファージの pH 安定性。すべての実験は独立して 3 回実行されました。 縦線は平均値の標準誤差を示します。 同じ文字でマークされたバーは、有意差がないことを示します (p < 0.05)。

S. ruminicola KCTC 43306 に対する単離された SBSEC ファージの溶菌効果を異なる MOI で比較しました。 図 4 に示すように、すべての MOI (0.001、0.01、0.1、1、および 10) の光学密度 (OD; 600 nm) 値は、最初の 2 時間で急速に増加しました。 その後、ファージ処理群の OD 600 nm 値は、陽性対照 (MOI 0) の値よりもかなり低くなりました。 両方のファージにおいて、ファージ処理群の OD 600 nm 値は、ファージ接種後 10 時間まで維持されるか (MOI 0.001、0.01、0.1、および 1)、または一定に減少しました (MOI 10)。宿主細胞はファージによって効果的に阻害されました。

異なるMOIでの単離されたSBSECファージの溶菌効果。 S. ルミニコラ KCTC 43,306 に対する MOI 10、1、0.1、0.01、および 0.001 でのファージ vB_SbRt-pBovineB21 (a) および vB_SbRt-pBovineS21 (b) の細胞溶解活性。対照としてファージを使用しませんでした。 各実験は独立して 3 回実施されました。 エラーバーは平均値の標準誤差を示します。

ファージ vB_SbRt-pBovineB21 および vB_SbRt-pBovineS21 のゲノムは、長さ 16,260 bp および 17,280 bp の直鎖状二本鎖 DNA で構成され、G + C 含有量が 33% 以上で、それぞれ 27 個と 26 個のオープン リーディング フレーム (ORF) が予測されました。 。 ゲノムマップを図 5a および図 5b に示します。 両方のファージにおいて、キャプシド形成タンパク質、DNA ポリメラーゼ、推定上の溶解システム関連タンパク質、ファージテールタンパク質、テールファイバータンパク質、ヘッドツーテールアダプター、アッパーカラータンパク質、および主要キャプシドタンパク質を含む 10 個の ORF が機能的タンパク質として予測されました。 さらに、ファージ由来タンパク質の相同性比較に基づいて、機能的に予測された ORF で 13 の保存ドメインが検出されました。 ファージ vB_SbRt-pBovineB21 および vB_SbRt-pBovineS21 の 10 以上の ORF は、連鎖球菌ファージ C119 からの予測タンパク質と類似していました (アミノ酸同一性; 25.5 ～ 63.6%)。 さらに、4 つ以上の ORF が GenBank データベースで入手可能な他のポドウイルス科ファージと類似しており (アミノ酸同一性 < 45%)、単離された SBSEC ファージが独特のゲノム構造を持っていることが示されました。 残りの ORF は仮説上のタンパク質として予測され、未知のタンパク質には BLASTP 検索を使用して注釈が付けられました。 さらに、膜貫通ドメインは 3 つの ORF で予測されましたが、両方のファージのすべての ORF でシグナルペプチドは予測されませんでした (補足表 1 および 2)。 tRNA 遺伝子と細菌の毒性および抗菌薬耐性に関連する遺伝子は、単離された両方のファージのゲノムでは検出されませんでした。 PhageTerm 分析では、単離されたファージの冗長末端で並べ替えられることが予測されました。 特に、ファージ vB_SbRt-pBovineB21 および vB_SbRt-pBovineS21 のゲノムは、18 の予測 ORF、および 4 つの機能グループ (2 つのヌクレオチド代謝、4 つのウイルス構造とパッケージング、4 つの溶解、および 3 つの尾部構造) に分類される 13 の推定機能タンパク質と高い類似性を示しました。 しかし、両方のファージは、ORF 13 と ORF 15 の間の遺伝子間領域に存在する遺伝子において明らかに異なっていました。ファージ vB_SbRt-pBovineS21 では、ORF 14 (171 bp) と ORF 15 (232 bp) は ORF 13 の隣に位置し、尾部をコードしていました。連続した 583 bp のタンパク質。 しかし、ファージvB_SbRt-pBovineS21に存在するORF14は、ファージvB_SbRt-pBovineB21では検出されなかった(図6)。

単離されたSBSECファージのゲノムマップ。 ファージ vB_SbRt-pBovineB21 (a) および vB_SbRt-pBovineS21 (b) の環状ゲノム マップは、機能カテゴリーに基づいて予測された各 ORF を色分けして示します: 仮説上のタンパク質 (青)、溶解システム (ピンク)、および追加のファージ関連タンパク質 (オレンジ）。 内側の黄緑色のレーンは、連鎖球菌ファージ C1 (AY212251.1) のゲノムに対する芽球相同性を表します。 GC 含有量、正の GC スキュー、および負の GC スキューは、それぞれ黒、緑、紫で示されます。

単離された SBSEC ファージと連鎖球菌ファージ C1 のゲノム比較。 線形視覚化は、ファージ ゲノムのコーディング領域を色付きの矢印で表します。 構造とパッケージング、DNA複製、宿主溶解、仮想タンパク質など、ファージ関連タンパク質に関連して機能注釈が付けられたORFは、青、ピンク、黄色、黒で色付けされました。 さらに、配列の類似性は灰色の強度によって示されます。

ファージ vB_SbRt-pBovineB21 および vB_SbRt-pBovineS21 の配列決定されたゲノムと、GenBank データベースで現在入手可能な他のファージとの比較により、単離されたファージは Streptococcus ファージ C1 (AY212251.1) に最も類似しており、<2 に基づく同一性 < 77% であることが示唆されました。 % クエリ カバレッジ (補足表 3)。 したがって、ICTV20によって提案された分類基準に基づいて、単離されたファージはラウンドツリーウイルス科に分類されました（補足表4）。 さらに、アミノ酸配列の類似性に基づいて、Easyfigを用いて単離されたSBSECファージとファージC1との間で比較ゲノム解析を行った。 分析により、SBSEC ファージの全体的なゲノム内容と配置が、ラウンドツリーウイルス科のフィスケッティウイルス属の唯一のメンバーであるファージ C1 のものと類似していることが明らかになりました。 しかし、SBSEC ファージは、ファージ C1 とはいくつかの違いを示しました。 (i) 同様の機能を持つ遺伝子のほとんどは 3 つのファージのゲノムに連続して位置していましたが、SBSEC ファージの予測される ORF のアミノ酸同一性の範囲は、ファージ C1 に対してファージ C1 は 63.6% 未満でした。 (ii) SBSEC ファージはファージ C119 と同様の宿主溶解システム (holin-plyCB-lil-plyCA) を持っていましたが、4 つの遺伝子 (lil (ORF 10 および ORF 9)、plyCB (ORF 11 および ORF 10)、holin (ORF 12 および ORF 11)、および plyCA (ORF 13 および ORF 12)) が配列決定されたゲノムに逆挿入されていることが判明し、holin と lil の内部位置が plyCB の周囲で変更されていることがわかりました (図 6)。したがって、ゲノム証拠は次のことを強く裏付けています。 vB_SbRt-pBovineB21 および vB_SbRt-pBovineS21 ファージはファージ C1 とは明らかに異なるため、新種と考えられます。 SBSEC ファージ vB_SbRt-pBovineB21 および vB_SbRt-pBovineS21 の分類学的位置を決定するために、単離された 2 つのファージとラウンドツリーウイルス科に属する他の 30 のファージの完全なゲノム配列を使用して、系統解析とドット プロットの比較が行われました (補足表 4)。 2つのSBSECファージは連鎖球菌ファージC1と一緒にクラスター化されていましたが、図7に示すように、ファージvB_SbRt-pBovineB21およびvB_SbRt-pBovineS21は異なるサブブランチに分離されました。主要キャプシドタンパク質を含む機能タンパク質を使用した追加の系統解析（補足図） .1a)およびDNAポリメラーゼ(補足図1b)も、ゲノムベースの分岐分析と一致する結果を明らかにした。 さらに、OrthoANIを使用したファージvB_SbRt-pBovineB21とvB_SbRt-pBovineS21の間の推定平均ヌクレオチド同一性は89.8%であり、得られたヒートマップは、2つのSBSECファージと連鎖球菌ファージC1についてクラスター化が存在しないことを示唆した(図8)。 これらの結果に基づいて、新たに単離された SBSEC ファージはフィスケッティウイルス属の新種と考えられる可能性があります。

配列決定された完全なゲノムに基づく、単離された SBSEC ファージの系統解析。 系統樹とドット プロットは、両方のファージがフィスケッティ ウイルス属の新しいメンバーとして連鎖球菌ファージ C1 とクラスター化していることを示しています。 色付きのボックスは、それぞれ、ラウンドツリーウイルス科に属するラキエテンウイルス亜科 (紫)、サーレスウイルス亜科 (緑)、フィスケッティウイルス属 (黄色)、およびネガーウイルス属 (ピンク) のメンバーによって表されます。 この研究で使用されたファージは太字で強調表示されています。 アウトグループは乳酸菌ファージ KSY1 (DQ535032.1) です。

この研究で分離された SBSEC ファージのヒート マップ。 単離された SBSEC ファージおよびラウンドツリーウイルス科ファージを含む 29 ゲノムの ANI 値を使用して描かれたマップは、ゲノム間の類似性に基づいたクラスター化を示しています。 この研究で使用されたファージは太字で示されています。

SBSEC バイオフィルム形成に対するファージの効果を評価するために、S. ルミニコラ KCTC 43,306 をさまざまな力価のファージ懸濁液とインキュベートしました。 バイオフィルム防止アッセイの結果は、異なる濃度（109、108、107、106、および105 PFU/mL）の両方のファージが、対照群よりも総バイオマスを着実に減少させることを示しました（図9aおよび9b）。 vB_SbRt-pBovineB21では、24時間のインキュベーション後に形成されたバイオフィルムで宿主細胞の生存率が5 log CFU/mL減少し、48時間後には最大2 log CFU/mLの減少に達しました（図9c）。 vB_SbRt-pBovineS21 では、バイオフィルム形成の段階的な減少が観察されました。 24時間および48時間のインキュベーション後に、対照と比較した場合、生細胞は4 log CFU/mL減少した(図9d)。 バイオフィルムに対するファージの溶解効果と生細胞の存在も、共焦点レーザー走査顕微鏡（CLSM）を使用して分析され、ファージはS.ルミニコラによって形成されたバイオフィルムを制御する可能性を示しました（図9e）。 ファージの潜在的なバイオフィルム防止能力も、合計 5 つの他のファージ感受性株 (S. インファンタリウス亜種インファンタリウス ATCC BAA-102 T、S. ギャロリティカス亜種ガロリティカス DSM 16831 T、S. エクイナス KCCM 90,374、 S. ruminicola KCTC 43308 T、および L. lactis subsp. lactis KCCM 41572 T）は、比較的高いバイオフィルム生成を示しました（データは示されていません）。 結果は、ファージvB_SbRt-pBovineB21およびvB_SbRt-pBovineS21が、比較的低用量のファージ濃度(107PFU/ml)で24時間、選択した5株のバイオフィルム形成を防ぐのに非常に効率的であることを示した(図10)。

単離されたSBSECファージのバイオフィルム防止能力。 24 時間および 48 時間のさまざまな濃度でのバイオフィルム形成の総バイオマスに対するファージ vB_SbRt-pBovineB21 (a) および vB_SbRt-pBovineS21 (b) の効果。 24 時間および 48 時間のさまざまな濃度でのバイオフィルムの生存細菌細胞に対するファージ vB_SbRt-pBovineB21 (c) および vB_SbRt-pBovineS21 (d) の効果。 対照は、ファージを含まない細菌培養物であった。 各実験は、S. ruminicola KCTC 43,306 を使用して独立して 3 回行いました。 異なる文字でマークされた値は、有意差を示します (p < 0.05)。 （ e ）2つの単離されたファージ（107 PFU / mL）で24および48時間処理したS.ルミニコラKCTC 43,306バイオフィルムのCLSM画像。 画像内で Syto 9 を使用して観察された緑色の蛍光は、生細胞を示しています。 スケールバーは100μMです。

この研究で使用した 5 つの細菌株に対する、単離された SBSEC ファージのバイオフィルム防止能力。 (a) 107 PFU/mL、24 時間でのバイオフィルム形成の総バイオマスに対するファージ vB_SbRt-pBovineB21 および vB_SbRt-pBovineS21 の効果。 対照は、ファージを含まない細菌培養物であった。 GraphPad Prism 7 を使用して箱ひげグラフにプロットされた値は、最小値と最大値とともにすべての点を明らかにしました。 各実験は独立して 3 回実施されました。 （ b ）2つの単離されたファージ（107 PFU / mL）で24時間処理された、選択された5つの細菌株バイオフィルムのCLSM画像。 Syto 9 を使用して観察された緑色の蛍光は、生細胞を示します。 スケールバーは100μMです。

SBSEC は動物や人間の消化管に生息する共生細菌です。 しかし、その増殖は反芻動物における乳酸性亜急性アシドーシスの引き金として作用します。 さらに、感染症患者において病原性があることが知られている代表的な種もいくつか報告されている。 最近、SBSEC の新しいメンバーである S. ruminicola が私たちのグループによって提案されました 3。 それにもかかわらず、SBSEC とこの細菌複合体に感染するファージの生物多様性についてはほとんど知られていません。 これは、代表的なSBSECに感染する両方の溶解性ファージの生物学的および遺伝的特性を報告した最初の研究であり、それによって第一胃微生物叢の潜在的な制御につながります（表2）。 単離されたファージは、主に、タイプ株とルーメンからの野生分離株の両方の SBSEC に感染しました 21。 興味深いことに、単離されたファージは、ルーメン内で急速に乳酸を生成するラクトバチルス属 22、23 やラクトコッカス属 24 などの他の乳酸生成細菌に対して広範な溶解活性を示しました 25。 この結果は、新たに単離されたファージが、代謝異常時に優勢なルーメン細菌によって生成される乳酸塩の過剰な蓄積を防ぐ可能性があることを示唆しています。

ICTV20の分類によれば、単離されたSBSECファージの形態学的特徴は、以前はポドウイルス科に属し、現在はラウンドツリーウイルス科のメンバーである連鎖球菌ファージC119の形態学的特徴と類似していた。 さらに、単離された SBSEC ファージの溶解特性は、両方のファージが 15 分以内に宿主細菌を吸着した後、SBSEC に対して効率的な抗菌活性を示しました。 吸着と細菌細胞の溶解開始の間の時間として定義される潜伏時間は 20 分でした。 さらに、感染した宿主細胞によって放出されるファージの数として定義されるバースト サイズは、感染細胞あたり 198 ～ 367.5 PFU でした。 これらの発見は、単離されたファージが、30 分で約 120 PFU/細胞 26 の腸球菌ファージ vB_EfaP_IME195、20 分で約 230 PFU/細胞のブドウ球菌ファージ CSA13 よりも、急速な吸着、より短い潜伏期間、および有意に大きなバースト サイズを示すことを示しました。 Rountreeviridae 科では mL27、Salasmaviridae 科では 50 分で約 9 PFU/mL28 の Streptococcus ファージ Cp-1。

温度やpHなどのさまざまな(過酷な)環境条件下での単離されたファージの安定性は、それらを潜在的な生物防除剤として使用する上で重要な特性です。 単離された SBSEC ファージはどちらも 4 ～ 45 °C で比較的安定であり、約 38 °C の第一胃環境における代謝活動への適応を示唆しています 29。 さらに、両方のファージは 3 ～ 12 の pH で安定しており、極度の酸性およびアルカリ性環境に対する強い pH 耐性を示しています。 第一胃内でデンプン分解細菌が最適に活動するための pH 条件は 5.4 ～ 630 の範囲であり、第一胃亜急性アシドーシス状態は pH 5.2 ～ 631 に維持する必要があります。 単離されたファージは低pHでも生存する能力があるため、これらの発見は重要であり、これにより反芻動物のSBSECを含む乳酸産生細菌によって引き起こされるルーメンアシドーシスが防止される可能性がある。 さらに、単離されたファージの環境安定性は、牛の糞便から単離された大腸菌ファージの環境安定性と一致しており、最適耐性はそれぞれ 37 ～ 40 °C および pH 6.3 ～ 8 であることが報告されています 32。 溶菌効果は、対照群と比較した場合、0.001 の最低 MOI で 2 時間以内に 2 log CFU/mL の減少として示されました。 これは、非常に低濃度で宿主細菌の生存を効果的に悪化させるため、潜在的な用途にとって有利です。

両方の SBSEC ファージのゲノム特性は、連鎖球菌ファージ C119 のゲノム特性に最も類似していました。 しかし、新たに単離されたファージは、ファージ C1 と比較するといくつかの異なるゲノム特徴を示し、次のようにフィスケッティウイルス属の新しいメンバーとして分類できます。 まず、両方の SBSEC ファージのゲノムは全体として、比較的低い同一性 (< 77%) を示しました。ファージ C1 と比較した場合、ヌクレオチド レベルのカバー率は 2%、ゲノム配列は明確です。 第二に、両方の SBSEC ファージで予測されたすべての ORF のうち、仮説上のタンパク質として注釈が付けられたのは半分だけでした。 3 つのタンパク質のそれぞれ (ファージ vB_SbRt-pBovineB21 の ORF 7、ORF 11、および ORF 20、およびファージ vB_SbRt-pBovineS21 の ORF 6、ORF 10、および ORF 20) は、ファージ関連遺伝子をコードすると予測されました。 第三に、両方の SBSEC ファージは、ファージ C1 とは似ているが異なる細菌溶解システムを持っていました。 連鎖球菌ファージ C1 は、それぞれ触媒ドメインと細胞壁結合ドメインをコードする plyCA および plyCB として同定される 2 つの特定の構造で構成される新規溶解素 PlyC を保有していることが報告されています 19,33,34。 この研究で新たに単離されたファージの配列決定されたゲノムは、plyCAおよびplyCBであると予測される、保存されたドメインを持つ2つの推定上のタンパク質（vB_SbRt-pBovineB21のORF 11およびORF 13、vB_SbRt-pBovineS21のORF 10およびORF 12）をそれぞれコードしていた。 それにもかかわらず、予測された遺伝子は、ファージC1との低い相同性および配置の差異を示した(図6)。 これらの結果から、新たに単離されたSBSECファージはファージC1とは異なる溶解系を有することが明らかになった。 したがって、将来の分析でそれらの独自性を確認するには、単離されたファージに由来するリシン関連酵素の潜在的な活性の詳細な特性に関する追加の研究が必要です。

現在まで、SBSEC によって引き起こされるバイオフィルムの存在と正確な役割についてはほとんど知られていません。 感染性心内膜炎の原因病原体として知られる 3 つの亜種を含む S. galloyticus のいくつかの株は、より高いバイオフィルム形成能力を有し、抗生物質耐性と有意に関連しています 35,36。 しかしながら、S.ルテティエンシスおよびS.インファンタリウス亜種の一部の菌株のバイオフィルム生成能力は、 乳製品から分離された乳児は有利な特性とみなされる可能性がある36。 前述の SBSEC 株と同様に、宿主株 KCTC 43,306 はバイオフィルムを生成することができ、バイオフィルム形成とバイオフィルム内の生存細菌細胞を効果的に減少させることができる抗バイオフィルム活性が単離されたファージに存在することを確認することができました。 興味深いことに、SBSEC および L. lactic subsp. の 5 つの菌株のバイオフィルムの形成は、 ラクティスもファージ接種によって予防された（図１０）。 ある研究では、バイオフィルムの減少に効果的なファージは、細菌細胞自体に感染するファージよりも広い宿主範囲を持っていることが報告されており 37 、これにより、新たに単離された SBSEC ファージが第一胃内でより多様な細菌種のバイオフィルム形成を制御する強力な可能性を秘めていることが示唆されています。 。 したがって、単離された SBSEC ファージは、抗バイオフィルムの可能性と乳酸産生細菌のバイオフィルムの予防に有効なファージとして認識される可能性があります。 新たに単離されたファージのゲノムに基づいて、ファージ由来のデポリメラーゼが細菌のバイオフィルム形成を特異的に制御する酵素として直接同定されていない。 しかし、ファージ vB_SbRt-pBovineB21 (ORF 14 および ORF 16) および vB_SbRt-pBovineS21 (ORF 13 および ORF 16) のゲノムにコードされている尾部タンパク質は、尾部繊維タンパク質または尾部スパイクタンパク質で見つかっている推定上のデポリメラーゼである可能性があります 38 、39。 したがって、今後の分析では、ファージの抗バイオフィルム活性の詳細なメカニズムを調査するために、さらなる研究が必要です。 これは、我々の知る限り、SBSECの代表者に感染する溶解性ファージの生物学的および遺伝的特性を報告し、その結果第一胃微生物叢を制御する可能性をもたらした最初の研究である(表2)。

この研究は、第一胃 SBSEC のさまざまな種 (または亜種) に感染する 2 つの新規溶解性ファージ (vB_SbRt-pBovineB21 および vB_SbRt-pBovineS21) に関する生物学的および遺伝的情報を提供します。 形態学的および遺伝的特性に基づいて、両方のファージをフィスケッティ ウイルスの新種として割り当てることができます。 さらに、比較ゲノム分析により、他の既知の連鎖球菌ファージと比較したときのその特異性が明らかになりました。 単離されたファージの広範な溶解活性により、動物やヒトの代謝障害を引き起こすSBSECおよび乳酸生成細菌に対する生物防除剤としての可能性が明らかになりました。 要約すると、新たに単離されたファージは、代替生物防除剤として第一胃微生物叢の安全性と安定性を向上させることができます。

合計 59 の SBSEC 株 (分離株 51 株と株 8 株)、S. agalactiae KCCM 11957 T、Lactobacillus plantarum subsp. plantarum KCTC 3108 T、Lactobacillus Sakei KCCM 40264 T、Lactobacillus casei KCCM12452T、およびLactococcus lactis subsp. 表 1 に示すように、lactis KCCM 41572 T をこの研究で使用しました。この研究で使用した 59 株の SBSEC 株のうち、51 株は以前に sodA 遺伝子配列分析に基づいて SBSEC メンバーとして同定されており、それらの潜在的な遺伝的多様性が決定されています 21。 すべての菌株をトリプシンソイ寒天 (TSA; Difco、米国) 中で 37 °C で 24 時間培養し、使用するまで 10% グリセロールを含むトリプシンソイブロス (TSB; Difco、米国) 中で -80 °C で保存しました。

この研究でファージの単離に使用した宿主細菌株は、新規の SBSEC3 として最近報告された S. ルミニコラ KCTC 43,306 でした。 ウシの糞便および下水からサンプルを収集し、SBSEC ファージを単離しました。 簡単に説明すると、TSB中で対数増殖期に増殖した宿主株を、等量の収集サンプルと37℃で24時間振盪しながら共培養した。 混合物を10,000×gで20分間遠心分離し、0.45μmシリンジフィルター(Millex、Merck Millipore Ltd.、アイルランド)で濾過した。 蒸留水中の濾液の段階希釈物を調製し、ＯＤ ６００ ｎｍが０．３の宿主株の培養物１ｍＬを含有する０．７％ＴＳＢ軟寒天上にプレーティングした。 このプロセスを少なくとも 3 回繰り返して、単一のプラークを取得しました。 その後、十分に分離されたファージを従来の二層寒天法 40 を使用して増殖させ、使用するまで 4 °C で保存しました。

単離された SBSEC ファージの形態を透過型電子顕微鏡を使用して検査しました。 ネガティブ染色の場合、増殖したファージ粒子 (約 109 PFU/mL) をグロー放電カーボンコート銅グリッド上に置き、室温で 2 分間吸収させてネガティブ染色しました。 サンプルを 2% (w/v) 酢酸ウラニル (UrAc; Electron Microscopy Sciences, Inc., USA) 溶液で 1 分間ネガティブ染色し、その後 UrAc を拭き取り、バイオ高電圧 EM システムを使用して観察しました。 (JEM-1400 Plus; JEOL Ltd.、日本) 韓国基礎科学研究院 (KBSI) で加速電圧 120 kV で。

単離された SBSEC ファージの宿主範囲を決定するために、60 の Streptococcus 種、3 つの Lactobacillus 種、および 1 つの Lactococcus 種を使用しました。 二重寒天法とスポットアッセイを使用してテストしました。 簡単に説明すると、10 μL のファージ溶解物 (約 109 PFU/mL) を二層寒天プレート上にスポットし、1 mL の細菌株培養物に添加しました。 37℃で24時間インキュベートした後、プレートの溶解ゾーン形成を観察しました。

吸着アッセイは前述のように実施されました 41。 対数期の宿主細菌株（約 108 CFU/mL）と MOI 0.0001 のファージ溶解物の 1:1 混合物を 37 °C でインキュベートしました。 ファージ接種後 0、5、10、13、15、17、20、25 分後にサンプル (100 μL) を収集し、12,000 × g、4 °C で 5 分間遠心分離しました。 遊離ファージの割合を決定するために、二層寒天法を使用して上清を 3 回培養しました。 前述のように、ワンステップ増殖アッセイを実行して、潜伏時間とバースト サイズを決定しました 41。 MOI 0.0001のファージ溶解物と対数増殖期の宿主株（約108 CFU/mL）を等量、37℃で15分間共培養し、宿主に吸着させました。 12,000 × g、4 °C で 5 分間遠心分離した後、上清を除去しました。 残りのペレットを 10 mL の予熱した TSB に再懸濁し、振盪しながら 37 °C でインキュベートしました。 懸濁液 (100 μL) を 0、5、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、および 100 分の時点で収集し、二層寒天法用にすぐに蒸留水で希釈しました。三重に。

単離された SBSEC ファージの熱安定性試験では、100 μL のファージ ライセート (約 108 PFU/mL) を 900 μL の 0.1 M PBS (pH 7.0) と混合し、4、16、25、37、45 ℃で静的にインキュベートしました。 56℃、80℃で3時間。 pH 安定性試験では、pH 2、3、4、4.6、5、900 μL の pH 緩衝液 (Samchun Chemicals、韓国) を含む一連のチューブに 100 μL のファージ ライセート (約 108 PFU/mL) を加えました。 6、7、8、9、10、11、および 12 に使用し、4 °C で 3 時間インキュベートしました。 すべての試験サンプルをインキュベートした後、二層寒天法を使用してファージ力価を 3 回測定しました。

SBSEC に対する単離 SBSEC ファージの溶菌効果を評価するために、以前に報告されているように宿主細胞溶解試験を実施しました 42。 TSB (10 mL) に宿主株を接種し、対数増殖期に達するまで 37 °C でインキュベートしました。 培養物に、MOI 0.001、0.01、0.1、1、および10でファージ溶解物を37℃で24時間振盪しながら接種し、ポジティブコントロールをMOI 0として使用しました。吸光度はODで測定することによって決定されました。 600 nm を 1 時間ごとに 10 時間、三重に実行しました。

Macrogen (韓国、ソウル) によって抽出された全ゲノム DNA は、TruSeq Nano DNA Library Prep Kit (Illumina、米国) を使用して DNA ライブラリを構築することにより、Illumina HiSeq X-10 プラットフォーム (Illumina、米国) で配列決定され、SPAdes (バージョン) を使用して組み立てられました。 . 3.13.0) ゲノム アセンブラ 43、さまざまな k-mer を使用します。 ゲノムの推定 ORF には、Subsystem Technology (RAST) サーバーからの Rapid Annotation を使用して注釈が付けられました 44。 配列の類似性を決定するために、すべての予測された ORF を BLASTP45 を使用して分析しました。 機能的に保存されたドメインは、Pfam-A (ver. 35)46 および RCSB PDB データベース 47 から HHpred48 を使用して既知のタンパク質と比較されました。 膜貫通ドメインは TMHMM 2.049 を使用して予測され、シグナルペプチドは SignalP (ver. 6.0)50 を使用して分析されました。 PhageTerm51は、Galaxyサーバーを使用して実行され、ファージ末端とパッケージングメカニズムを決定しました。 tRNAscan-SE 2.052を使用して、単離されたSBSECファージのゲノムをtRNAについてスクリーニングした。 さらに、病原性細菌の毒性因子データベース (VFDB) 53 および抗生物質耐性遺伝子 ANNOTation (ARG-ANNOT) 54 を使用して、病原性および抗生物質耐性遺伝子が検出されました。

単離された SBSEC ファージのゲノム マップは、CGView Server55 を使用して視覚化されました。 GenBank にある Rountreeviridae ファミリー株を含む単離された SBSEC ファージの利用可能なゲノムに基づく系統樹は、ウイルス分類およびツリー構築オンライン リソース システム 56 およびゲノム BLAST 距離系統解析法 57 を使用して構築されました。 ツリーの分岐サポートは、式 D0 の後処理 FastME (バージョン 2.1.6.1)58 を使用して推論されました。 主要キャプシドタンパク質および DNA ポリメラーゼをコードするアミノ酸配列は、Clustal X (ver. 2.1)59 および BioEdit (ver. 7.1.0.3)60 を使用して整列され、MEGA X61 の最尤法 (ML) 法を使用して単一の系統樹が構築されました。 ブートストラップ値は 100 回の反復について計算されました。 ゲノム配列のドット プロットは、Gepard 2.1 を使用し、デフォルト設定で生成されました62。 OrthoANI63 を使用して、GenBank データベース内の Rountreeviridae ファミリーに属する 30 ファージ株の平均ヌクレオチド同一性 (ANI) 値を計算しました。 ANI 値に基づくヒート マップは、R パッケージ ヒートマップ (バージョン 4.1.2)64 を使用して生成されました。 単離された連鎖球菌ファージ C1 と密接に関連する SBSEC ファージの比較分析を、Easyfig65 を使用して実施しました。

宿主株によるバイオフィルム形成の防止における単離された SBSEC ファージの有効性は、以前に報告されているように評価されました 41。 1% スクロースおよび 1% CaCl2 を 0.1 M の濃度で補充した TSB ブロス (TSBs-CaCl2) は、バイオフィルムの形成を助けるため、これらのアッセイを実行するために使用されました。 一晩培養した宿主株 (約 108 CFU/mL) を TSBs-CaCl2 で 1:100 に希釈し、この希釈培養物の 100 μL アリコートをさまざまな濃度 (105、106、107、108、および 109 PFU/mL) のファージ ライセートと混合しました。 mL）を等量加えます。 混合物を滅菌平底96ウェルプレート(SPL Life Sciences、韓国)の各ウェルに加え、37℃で24時間および48時間インキュベートした。 ファージを含まないTSBをネガティブコントロールとした。 次に、プレートの上清を蒸留水で 3 回洗浄して浮遊細胞を除去し、各ウェルに形成されたバイオフィルムを 0.1% クリスタルバイオレット (CV; Sigma, UK) で室温で 20 分間染色しました。 各ウェルのCVを洗浄し、100μLのエタノールに溶解し、マイクロプレートリーダー（Spectramax 190、Molecular Devices、USA）を使用してODを595 nmで測定した。 バイオフィルム内の生存細菌細胞を計数するために、再懸濁した蒸留水の段階希釈を使用して CFU を決定しました。 他のファージ感受性株によるバイオフィルム形成の防止における単離された SBSEC ファージの有効性も、単一濃度のファージ ライセート (107 PFU/mL) を使用して評価し、結果を 37 °C で 24 時間インキュベートすることによって分析しました。

単離された SBSEC ファージのバイオフィルム防止能力は、CLSM (LSM 800 META、Zeiss、ドイツ) を使用したイメージングによって観察されました。 各ファージ (106 PFU/mL) で処理したバイオフィルムを、未処理のファージと比較して、表面処理されていない 6 ウェル プレート (SPL lifesciences、韓国) に配置された滅菌カバースリップ (Marienfeld-Superior、ドイツ) 内で 37 ° で培養しました。 ３℃で２４時間および４８時間放置した。 形成されたバイオフィルムを暗所で 20 分間 Syto 9 (BacLight、Thermo Fisher、USA) で染色しました。 各ウェル内の染色されたバイオフィルムをスライド ガラス (Marienfeld-Superior、ドイツ) にマウントしました。 緑色蛍光を発する生細胞数は、488 nm での励起と 498 nm での発光によって検出され、CLSM を使用する 10 倍の対物レンズを使用して視覚化されました。

統計分析は、GraphPad Prism 7 (GraphPad Software Inc.、サンディエゴ、カリフォルニア州、米国) を使用して実施され、スチューデントの t 検定を使用した 2 つのグループの比較と、テューキーの検定による二元配置分散分析 (ANOVA) を使用した多グループの比較が実行されました。 。 有意水準は p < 0.05 (*) に設定されました。

単離された SBSEC ファージの完全なゲノム配列は、アクセッション番号 ON759209 (ファージ vB_SbRt-pBovineB21) および ON759210 (ファージ vB_SbRt-pBovineS21) で GenBank に寄託されています。 SBSEC ファージ vB_SbRt-pBovineB21 は KCCM13031P の下で KCCM に寄託され、vB_SbRt-pBovineS21 は KCTC 4834 の下で KCTC に寄託されました。

この研究中に生成または分析されたすべてのデータは、この公開された論文とその補足情報ファイルに含まれています。 単離された SBSEC ファージの完全なゲノム配列は、アクセッション番号 ON759209 (ファージ vB_SbRt-pBovineB21) および ON759210 (ファージ vB_SbRt-pBovineS21) で GenBank に寄託されています。

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この研究は、2022年度嘉泉大学研究基金(GCU-202110530001)と海洋部の資金提供を受けた韓国海洋科学技術振興院(KIMST)の海洋漁業副産物の生物物質化技術開発の支援を受けて行われた。および水産 (KIMST-20220128)。

これらの著者は同様に貢献しました: Seon Young Park と Hyemin Kwon。

忠南国立大学農業生命科学部動物乳製品科学部、大田、34134、韓国

パク・ソンヨン＆ソ・ソンウォン

忠南国立大学生物科学バイオテクノロジー学部微生物学および分子生物学科、大田、34134、韓国

クォン・ヘミン

ソウル国立大学獣医学部および獣医学研究所水生生物医学研究室、ソウル、08826、韓国

サングエン・キム＆セチャン・パク

食品科学およびバイオテクノロジー学科、カチョン大学バイオナノ技術学部、城南、13120、韓国

キム・ジヒョン

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SYP、JHK、SS が原稿のアイデアを考案し、SGK と SCP が生物学的実験に参加しました。 SYP、HK、JHK はサンプルを準備し、生物学的実験を実施しました。 SYP と SS が主に原稿の作成を担当しました。 HK は統計分析を実行しました。 SGK、JHK、および SCP がこの研究を考案し、原稿の草稿を支援しました。 著者全員が最終原稿を確認し、承認しました。

キム・ジヒョンまたはソ・ソンウォンへの通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

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転載と許可

Park、SY、Kwon、H.、Kim、SG 他韓国の反芻動物からのウシ連鎖球菌/馬子複合体 (SBSEC) に感染する 2 つの溶解性バクテリオファージの特性評価。 Sci Rep 13、9110 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41598-023-36306-x

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受信日: 2023 年 2 月 17 日

受理日: 2023 年 5 月 31 日

公開日: 2023 年 6 月 5 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-36306-x

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