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Jul 30, 2023

繊毛

Rapporti scientifici Volume 13,

Scientific Reports volume 13、記事番号: 8205 (2023) この記事を引用

396 アクセス

1 オルトメトリック

メトリクスの詳細

一次繊毛は、細胞外の合図を細胞内シグナルに統合する保存された細胞小器官であり、細胞の発生や修復応答などのさまざまなプロセスにとって重要です。 繊毛機能の欠損は、繊毛症として知られる多全身性のヒト疾患を引き起こします。 眼では、網膜色素上皮 (RPE) の萎縮が多くの繊毛症の共通の特徴です。 しかし、生体内での RPE 繊毛の役割はまだ十分に理解されていません。 この研究で、マウス RPE 細胞が一次繊毛を一時的にのみ形成することを初めて発見しました。 次に、ヒトの網膜変性と関連する繊毛症であるバルデ・ビードル症候群 4 (BBS4) のマウスモデルで RPE を調べたところ、BBS4 変異体 RPE 細胞の繊毛形成が発生の初期段階で破壊されていることを発見しました。 次に、生体内でのレーザー誘発損傷モデルを使用して、RPE の創傷治癒中にレーザー損傷に反応して RPE の一次繊毛が再集合し、修復完了後に急速に分解することを発見しました。 最後に、我々は、繊毛喪失の条件付きマウスモデルにおける一次繊毛のRPE特異的枯渇が、創傷治癒を促進し、細胞増殖を促進することを実証した。 要約すると、我々のデータは、RPE繊毛が網膜の発達と修復の両方に寄与し、より一般的なRPE変性疾患の潜在的な治療標的についての洞察を提供することを示唆しています。

網膜色素上皮 (RPE) は、光受容体との相互作用が網膜の維持に重要であるため、光受容体の発達と視覚機能に不可欠な細胞の極性単層です。 したがって、RPE の機能不全は、黄斑変性を含む多くの疾患に関連しています 1、2、3、4、5。 加齢黄斑変性症（AMD）は、高齢者における不可逆的な失明の主な原因です6、7、8。 滲出性AMDの治療はかなり進歩しているにもかかわらず、診断された全症例の90%を占める乾性AMDを治療する効果的な戦略はありません9、10、11。 RPE の喪失は AMD の主な原因であると考えられています 12、13、14、15。 内因性 RPE 再生の可能性を理解することで、乾性 AMD などの疾患に対する新たな潜在的な治療戦略が明らかになる可能性があります 16、17、18、19。

一次繊毛は、ほぼすべての有糸分裂後の哺乳類細胞タイプに存在する孤立した微小管に基づく構造です20、21、22、23、24、25、26。 この小さな細胞付属器は、外部環境の変化を検出し、これらの合図を細胞内シグナル伝達カスケードに変換することができます。 それらは正常な胚形成に不可欠であるため、一次繊毛の破壊はほぼすべての臓器系で発生奇形を引き起こします20、27、28、29、30、31、32。 一次繊毛は、細胞増殖や創傷修復などの発生後のプロセスでも重要な役割を果たします20、33、34、35、36、37、38、39。 繊毛の形成と機能に必要な遺伝子の変異は、総称して繊毛病と呼ばれる一連のヒト疾患を引き起こし、多発性嚢胞腎、肥満、網膜変性、RPE萎縮などの臨床障害として現れます40、41、42、43、44、45。 IFT88 は、繊毛形成に必要な鞭毛内輸送複合体の一部です 46。 典型的な繊毛症であるバルデ・ビードル症候群 (BBS) は、BBS 遺伝子の変異によって引き起こされます。 毛様体コンパートメントのシグナル伝達組成の調節に重要な重要な多量体タンパク質複合体である BBSome のいくつかの BBS 遺伝子の産物 47、48、49、50、51、52。 BBSome メンバーである BBS4 は、細胞増殖と繊毛の維持において複数の役割を果たしています 53,54。

細胞の増殖と移動を調整する際の繊毛の役割を裏付ける証拠が増えており、繊毛が機能不全に陥ると、創傷治癒の欠陥を引き起こす可能性がある33,34,37,55,56,57,58,59。 繊毛は移動方向を向いているため、一次繊毛は組織修復中の方向性のある細胞移動の周期プロセスに関与している可能性があると考えられています 37,58。 たとえば、皮膚細胞では、一次繊毛が創傷治癒における増殖の制御に主要な役割を果たしています60。 欠陥のある繊毛が、さまざまな疾患の発症時に細胞増殖を促進することは広く知られています 33,56,61。 別の例では、マウスの腎臓集合管細胞における異なる鞭毛内輸送遺伝子である IFT20 が欠失すると、増殖と嚢胞の発生が生じ、嚢胞性腎疾患が引き起こされます 62。

不死化 RPE 細胞株は、繊毛タンパク質複合体と繊毛形成を研究するためのモデル系として広く使用されています 22,38。 しかし、生体内での RPE 繊毛の役割はほとんど知られていないままでした。 最近、繊毛が RPE の成熟に必要であることが発見されました 63,64。 げっ歯類の RPE 繊毛は成熟後に吸収されるため 64,65、繊毛の再生が成人期の RPE の修復活動と再生に寄与するかどうかは不明のままです。

ここでは、標的レーザーアブレーションに対するマウスの RPE の増殖および修復反応における一次繊毛の役割を調査しました。 我々は、BBS4が生体内でのRPE繊毛形成において重要な役割を果たしていることを示す。 トランスジェニックマウスと免疫蛍光技術を利用して、成体マウスのRPEの一次繊毛が創傷治癒中にレーザー誘発性損傷に応答して再構築されるという証拠も提供します。 さらに、我々は、Ift88 の条件付き対立遺伝子を利用して、出生後 RPE における繊毛とその形成の可能性を除去することにより、一次繊毛の機能を特徴付けます。 我々は、繊毛の除去が細胞増殖を促進することにより組織修復を促進することを実証しました。

以前の研究では、げっ歯類の RPE の一次繊毛は網膜の成熟後に分解することが報告されています 64,65。 しかし、繊毛分解のタイミングは、色素沈着した C57BL/6 マウスと比較してラットでは大きく異なります 64,65。 ラットでは生後 1 日目 (P1) には 60% 以上の RPE 細胞が繊毛を含んでいますが、C57BL6 マウスでは繊毛のある RPE はわずかしか見つかりません。 私たちは、これがマウスとラットの種の違いによるものなのかどうかを知ることに興味がありました。 別の系統のマウスRPEで繊毛がどの程度吸収されるかをさらに調査するために、P0からP21までのフラットマウント網膜標本でアルビノCD1マウスのRPEを分析しました（図1A）。 一次繊毛は、一般的に使用される繊毛膜マーカーである Arl13b の免疫蛍光によって同定されました 57,66。 タイトジャンクションは、ZO-167 の免疫蛍光によって視覚化されました。 一次繊毛を有する RPE 細胞は生後 0 日 (P0) では豊富でしたが、網膜がほぼ成熟していると考えられる生後 3 週間の動物 (P21) ではその頻度が大幅に減少しました。 興味深いことに、色素沈着マウスでは、中心領域（視神経近く）の繊毛細胞の割合がP7で最も高かった（約80％）のに対し、P7では繊毛RPEはほんのわずかしか検出されませんでした64。 P14までに、繊毛細胞の減少は、末梢RPEよりも中枢RPEで有意に大きかった。 P21では末梢および中枢RPEの両方で一次繊毛は検出されず、これは、ほとんどのRPE細胞が繊毛を失ったか、繊毛の長さが減少したか、またはもはやArl14b陽性でなくなったことを示唆しています（図1B）。 Arl13b 染色毛様体の長さの変化は繊毛吸収に伴い、平均長さは中心領域では P0 の 1.4 μm から P14 の 0.2 μm に減少し、周辺領域では P0 の 1.1 μm から P14 の 0.6 μm に減少しました（図 1C）。 さまざまな発生段階での RPE 細胞領域の分析では、中心領域と周辺領域の両方で細胞サイズが徐々に増加する傾向が示されました (図 1D)。 興味深いことに、発生段階で二繊毛性RPEのグループが観察されました（図S1）。 P0 では、繊毛のある RPE の 1.62 ± 1.44% が末梢領域で二繊毛であったのに対し、中心領域では 10.26 ± 5.43% でした。 Ｐ７では、繊毛ＲＰＥの１２．１１±３．５０％が末梢領域で二繊毛であったのに対し、中心領域では１３．５８±６．９９％であった。 二繊毛化されたRPEは、単核または二核のいずれかでした。 総合すると、これらの結果は、CD1 マウスにおける一次繊毛の吸収のタイミングが C57CL6 とは異なることを示しました。 さらに、CD1 マウスの中心領域と末梢領域では繊毛の分解が異なります。 これらのマウスのＲＰＥでは、末梢領域ではＰ０から始まり、中心領域ではＰ７から繊毛が徐々に分解され、Ｐ２１までにほとんど存在しないように見える。

アルビノマウスRPEにおける発生中の一次繊毛の分解。 一次繊毛の組み立てと分解は、CD1 アルビノ マウスの RPE の発生中に動的に調節されます。 (A) RPE の周辺領域または中心領域を示す、さまざまな出生後年齢のフラット マウント網膜サンプルからの共焦点画像。 ZO-1 染色細胞接合部 (赤)、Arl13b は毛様体マーカー (緑)、核 (青)。 対応する各画像の倍率が表示されます。 スケールバー: 小さい 20 μm。 20μmの拡大画像。 矢印は繊毛を示します。 (B) 発生中の RPE における繊毛の定量化。 P0 n = 50 セル、P7 n = 50 セル、P14 n = 50 セル、P21 n = 50 セル。 目の数: 時点ごとに 3 または 4。 (C) 繊毛の長さの定量化 (D) 細胞面積の定量化。 スチューデントの t 検定を使用して統計分析を実行し、p < 0.05 を統計的に有意であるとみなしました。

BBS4 ノックアウト マウスは、網膜変性を含むヒト繊毛症の表現型の多くを再現します 68。 BBS4がRPEの繊毛形成と成熟に役割を果たし、網膜変性に寄与する可能性があるかどうかを調べるために、CD1アルビノでとったのと同じアプローチを使用して、P0の生殖系列Bbs4ヌルマウスからのフラットマウントと年齢を一致させた対照でRPEを分析しました。分析（図2A）。 我々の結果は、Bbs4-null RPEでは対照細胞と比較して繊毛レベルが大幅に減少していることを示しました。 中央領域については、Bbs4 ヌルマウスの RPE フラットマウントの繊毛率は 53.8% であったのに対し、年齢を一致させた対照グループでは 74.9% でした。 末梢領域については、Bbs4 ヌルマウスの RPE フラットマウントの繊毛率は、野生型コントロールの 78.1% と比較して 51.2% でした (図 2B)。 繊毛結果と一致して、Bbs4-null RPE では、中心領域と末梢領域の両方で対照と比較して、繊毛の長さも適度に短かったが（図 2C）、その差は統計的に有意ではなかった。 RPE フラットマウントの平均毛様体長は、Bb4 ヌル マウスの中心領域で 1.3 μm、野生型コントロールでは 1.6 μm でした。 BbsヌルRPEでは周辺領域で1.2μm、野生型コントロールでは1.6μm。 さらに、変異体グループの中心領域では細胞サイズが増加する傾向があったのに対し、周辺領域の細胞サイズは変化しませんでした（図 2D）。 さらに、一般的な ZO-1 発現レベルでは、対照マウスと Bbs4 ヌル マウスの間に有意な差がないことが明らかになりました。

BBS4 の喪失は、生体内での RPE の繊毛に影響を与えます。 BBS4 ノックアウトは、生体内で RPE 繊毛を変化させます。 (A) 一次繊毛および細胞接合部に対する抗体で標識された、WT および BBS4 ヌル同腹子の末梢および中心領域の両方からの P0 マウス RPE フラットマウントの代表的な免疫蛍光画像 (緑色は Arl13b、赤色は ZO-1) スケール バー: 小 20 μm; 20μmの拡大画像。 矢印は繊毛を示します。 (B) 発生中の RPE における繊毛の定量化。 各年齢グループについて、RPE の中心または末梢で平均約 200 ～ 300 個の細胞がカウントされました。 n = 3 目。 (C) 発生中の RPE の毛様体長の定量化。 (D) 発生中の RPE の細胞サイズの定量化。 スケールバー: 20 μm。 n = 1。(B) ～ (D) の統計分析はスチューデントの t 検定を使用して実行され、P < 0.05 が統計的に有意であるとみなされます。

我々はさらに、成人のRPE組織における毛様体のプロファイルを調査しました。 免疫組織化学を行う前に、無傷の組織を透明にする iDiSCO クリアリング法を使用しました 69。 その結果、ARL13B標識によって確認されたように、成人のヒトRPEが一次繊毛を形成し、単層全体のほぼすべての細胞に繊毛が存在することが明らかになりました（図3）。 一次繊毛の平均長は3.2μmであった。 さらに、AMD患者（n = 1）のRPEでは、健康なRPEと比較して、繊毛と繊毛の長さの両方が大幅に減少していることがわかりました。 これらの結果を総合すると、ヒトのRPEは、黄斑のないマウスの対応物とは異なり、成人では一次繊毛を形成することが示された。これは、繊毛がヒトのRPEにおいて役割を果たしており、その役割は発生が完了した後も持続すること、また繊毛がヒトの疾患状態において欠陥がある可能性があることを示唆している。黄斑変性症として。

AMD患者のRPEにおける一次繊毛の欠陥。 (A) 健康なヒト RPE および AMD 患者の Arl13b (緑色) および ZO-1 (赤色) について染色された共焦点画像。 (B) RPE における繊毛の定量化 (各ヒト RPE サンプルの周辺領域から 4 ～ 5 個の個別の 63 × 共焦点画像を画像化/計数しました。223 × 223 μm2/画像)。 (C) RPE における毛様体の長さの定量化。 スケールバー: 10 μm。 n = 1。(B) ～ (D) の統計分析はスチューデントの t 検定を使用して実行され、p < 0.05 が統計的に有意であるとみなされます。

繊毛の喪失が生体内で出生後のRPEに影響を与えるかどうかを理解するために、我々は、RPE選択的な一次繊毛の生後喪失を有するトランスジェニックマウス（RPE-cKOマウス）を作製した。 私たちは、繊毛の形成と維持に不可欠な鞭毛内輸送タンパク質（Ift88）の条件付き（フロックス化）対立遺伝子と、BEST1 プロモーターによって駆動される Cre 対立遺伝子を組み合わせて、RPE 特異的な繊毛の喪失を引き起こしました。 BEST1-Cre 導入遺伝子は、生後約 P1070,71 で始まる眼の Cre 発現を駆動します。 RPEにおけるBEST1-Creのモザイク発現により、RPEおよび網膜の対照隣接細胞に対する繊毛喪失の影響を同時に評価することができました。 ジェノタイピングを実行し、すべてのマウスのRPEフラットマウントで免疫染色によってCre発現を検査し、その後、さらなる分析のために90％発現したマウスに焦点を当てました（図4A、B）。 RPEフラットマウントおよびスリットランプでRPE-cKOマウスの斑状の色素欠損（局所的な色素沈着低下）を観察しました（図4C、D、図S3）。 RPE-cKO マウスの RPE 成熟を調査するために、RPE-cKO マウスとコントロール マウスの RPE フラットマウント上の RPE65 の蛍光強度を比較しました。 中心領域と周辺領域の両方を分析しました（図4E〜G）。 我々は、対照群と比較して、RPE-cKO マウスにおける RPE65 発現の有意な減少を発見しました。 次に、RPE-cKOマウスとコントロールマウスでRPEの極性マーカーであるエズリンとZO-1の両方の発現を比較しましたが、違いは見つかりませんでした（図S2）。 RPE-cKO マウスの光受容体の形態と機能を評価するために、生後 2 か月および 6 か月のマウスの OCT イメージングによる光受容体層の厚さと ERG による光受容体の電気的応答を評価しました（図 4H–M、図 S2）。 。 暗所視（暗順応）または明所視（明順応）の ERG 反応は、生後 2 か月または 6 か月のいずれにおいても、RPE-cKO マウスと対照との間で b 波または a 波の振幅に有意な差を示さなかった。 これらのデータは、RPE が軽度に損傷を受けているが、光受容体の活性を損傷するほど深刻ではないことを示唆しています。

マウスにおける条件付き繊毛喪失時の色素沈着低下と RPE65 の喪失。 条件付き繊毛喪失が RPE、網膜、視覚機能に与える影響の評価。 (A、B) Cre 抗体 (赤) で染色された RPE フラットマウントは、RPE-cKO グループにおける Cre 発現を明らかにします。 (C、D) RPE-cKO マウスからの RPE フラットマウントは、赤いボックスで示された末梢 RPE の局所的な色素沈着低下を示しています。 スケールバー: 300 μm。 (E、F) 生後 2 か月のノックアウト グループとコントロール グループの両方における RPE フラットマウントでの RPE65 染色 (緑色)。 グラフは、時間の経過に伴う RPE65 染色の定量的蛍光レベルを示します。 (H – J) 生後 2 か月から生後 6 か月までのコントロールおよび RPE-cKO マウス網膜の SD-OCT 画像。 両方の時点から得られた外核層 (ONL) の厚さの測定。 (K-M) RPE-cKO マウスとコントロール マウスの網膜電図 (ERG) 記録。 杆体光受容体機能を示す暗順応ERG。 オンリー; 外核層、RGL。 網膜神経節細胞層、INL。 内核層。 2ヶ月のRPE-cKOグループのn = 3匹の動物。 n = 2 か月の対照群の動物 5 匹。 n = 6ヶ月のRPE-cKOグループの5匹の動物。 n = 6 か月の対照動物 3 匹。 統計分析は一元配置分散分析を使用して実行され、p < 0.05 が統計的に有意であるとみなされました。 スケールバー: 20 μm。

マウス角膜内皮では、一次繊毛は成体になると分解しますが、損傷による組織修復に応答して再組み立てされます72。 これらの発見は、RPE 繊毛も損傷や損傷に反応して再形成する可能性があるという仮説につながります。 我々は、生体内での RPE 創傷治癒を調査するために一般的に使用されているレーザー光凝固誘発損傷アプローチを使用して、このアイデアをテストすることにしました 73,74,75。 我々は、二重トランスジェニック繊毛および基底小体レポーターマウス（Arl13b-mCherry; Centrin2-GFP）に対してレーザー光凝固術を実行しました。これにより、蛍光顕微鏡を使用して生体内で繊毛、中心小体および基底小体を直接視覚化できるようになります76、77、78、79。 RPE/脈絡膜層は、レーザー損傷後のさまざまな時点で採取されました。 RPE 境界は ZO-1 でラベル付けされ、フラットマウントとして画像化されました。 我々は、マウスRPEがRPE創傷治癒中に移動および新たに増殖した細胞上で繊毛を再形成することによって損傷に応答し、修復が完了したように見えるときに一次繊毛が吸収されることを発見した（図5A）。 具体的には、レーザー損傷後 1 時間で、RPE 細胞の境界がレーザースポットパターンの明確なエッジ内で減少しており、この領域での RPE 細胞の損失が示されています。 レーザー照射領域に隣接する RPE は六角形のままで、繊毛がありませんでした。 損傷の48時間後、一次繊毛(Arl13b-mcherryレポーターがセントリン-GFP基底体に隣接して出現)が、拡大し新たに増殖している隣接細胞(小さいサイズの細胞)上で初めて検出可能になった。 損傷から 72 時間後、レーザー照射領域の大部分は細胞と追加の繊毛細胞で覆われていました。 興味深いことに、少数の散発的な繊毛のある RPE がレーザー部位から 500 μm 離れたレーザー照射されていない領域でも検出されており、形態が変化していないにもかかわらず追加の RPE 細胞も反応していることを示唆しています。 修復が完了して以来、レーザー損傷後 7 日目には一次繊毛はかろうじて検出されました。 修復プロセス中の繊毛と繊毛の長さを測定したところ、レーザー照射後72時間で繊毛が最大になることが示されました（図5B、C）。 我々はさらに、記載されているように基底体と細胞中央値との間の距離を測定することにより、基底体の位置が移動方向に関連するかどうかを調査した72。 我々の結果は、創傷治癒中に有意な差を示さず、R​​PE繊毛が修復における細胞パターンに関与していないことを示した(図5D)。 要約すると、我々のデータは、創傷治癒中に成体RPE細胞上で一次繊毛が再形成されることを示し、新たに形成された繊毛がin vivoでのマウスRPEの創傷治癒に寄与する可能性があることを示した。

修復中の成人RPEにおける一次繊毛の再構築。 (A) レーザー損傷後 0、2、3、7 日後の RPE フラットマウントの創傷領域を示す代表的な免疫蛍光画像。 レーザー領域（黄色の点線の円）と、マークされた繊毛（赤のArl13bおよび緑のCentrin2）およびRPEの境界（白）がRPEフラットマウント上に示されています。 レーザー後 1 時間では、レーザー領域近くの RPE は緩和されたままです。 一次繊毛 (赤い円) は、72 時間のレーザー領域近くの移動および新たに増殖した RPE で検出され、レーザー後 8 日目にはほとんど検出されません。 細胞境界はZO-1で染色された白色、Arl13bは赤色、Centrin2は緑色で示されている。 (B、C) 繊毛と繊毛の長さの定量化 (n = 4)。 (D) 基底体の位置と細胞培地の間の測定。 n = 1 グループあたり 3 匹の動物。 スケールバー: 20 μm。 統計分析は一元配置分散分析を使用して実行され、p < 0.05 が統計的に有意であるとみなされます。

以前の研究では、レーザー光凝固により、創傷治癒過程中にマウスの眼で RPE 細胞が増殖することが示されています 73,80,81。 この RPE 創傷修復と増殖に一次繊毛が関与していることを調査するために、条件付き RPE-cKO マウスと年齢を一致させた対照にレーザー光凝固を使用して一定のサイズの損傷を生成し、創傷治癒を誘導しました。 レーザー投与の24時間後および48時間後にRPE/脈絡膜層を収集し、フラットマウント上のファロイジン染色によってRPEの形態を視覚化しました。 レーザー治療の 24 時間後、両グループで創傷サイズに有意差は検出されませんでした。 驚くべきことに、創傷領域のサイズは、対照と比較してRPE-cKOグループで大幅に減少し、対照グループでは、創傷領域全体の再表面化は48時間の時点で不完全なままでした（図6A、B）。 RPE-cKO グループでは、この時点で治癒がほぼ完了していました。 年齢を一致させた対照群と比較して、48時間のレーザー治療後のRPE-cKOマウスでは、Arl13bシグナルに基づく一次繊毛再構築率が大幅に低下していることがわかりました（図S4、年齢が一致した対照群では48.70±4.71％） RPE-cKO マウスでは対照群が 8.06 ± 4.95%）。 欠損繊毛が増殖活性を調節することによってRPE創傷治癒を促進するかどうかを調べるために、レーザー処理したRPE層（直径200μm）のファロイジン染色および核染色によって決定される総細胞数を評価しました。 分析により、両方の時点で対照と比較して、RPE-cKO変異体グループのレーザー治療領域における細胞数が有意に増加していることが示されました（図6C）。 Ki67 陽性細胞は、レーザー治療領域の RPE 層と隣接する未治療領域で見つかりました。 次に、ほとんどの増殖細胞を含む、直径 500 μm 以内の Ki67 陽性細胞の数を評価したところ、レーザー後 24 時間で RPE-cKO 群と対照群の間に有意な差が見つかり、欠陥のある繊毛が治癒中の細胞増殖を促進したことが示されました。 。 Ki67 陽性細胞は、レーザー後 48 時間の時点で両方のグループに存在していました。 総合すると、これらの結果は、欠陥のある繊毛がマウス RPE の創傷治癒を促進することを実証しました。

欠陥のある繊毛は、増殖を制御することによって RPE の創傷治癒を促進します。 (A) レーザー治療後 24 時間および 48 時間の RPE-cKO および対照マウスの RPE フラットマウントにおけるファロイジン (赤色) および Ki67 (黄色) 抗体の免疫蛍光分析。 レーザー光凝固の 24 時間後および 48 時間後に成体 RPE-cKO マウスおよび対照マウスから RPE フラットマウントを調製し (24 時間: n = 6 および 10 の眼; 48 時間: n = 4 および 8 の眼)、Ki67 (増殖細胞マーカー) で染色しました。 ）およびファロイジン（細胞境界）。 (B) ファロイジン染色に基づく RPE-cKO グループとコントロール グループの創傷サイズの定量化。手動補正を使用して ImageJ によって分析されました (分析中にサンプル グループを盲検化)。 (C) レーザー領域 (200 μm) 内の細胞数の定量化。 (D) 500 μm 以内の Ki67 陽性細胞数の定量化。 スケールバー: 20 μm。 スチューデントの t 検定を使用して統計分析を実行し、p < 0.05 を統計的に有意であるとみなしました。

ここでは、成体マウス RPE の創傷修復における一次繊毛の新しい役割について説明します。 私たちは最初に、以前の報告とは異なるマウス系統で一次繊毛の収縮を確認し、BBS4が繊毛に寄与していることを実証しました。 これらのデータは、発生中の RPE 繊毛に関する以前の発見を拡張します 63,64。 また、ヒトの成人期には一次繊毛がRPE上に存続することもわかり、成熟後も一次繊毛が細胞機能に寄与し続けることが示唆されました。 さらに、一次繊毛は損傷後に再構築され、修復プロセス中に存続すること、RPEからのIft88の条件付き枯渇が増殖に影響を及ぼし、それが創傷治癒を促進することを示しました。

in vivoでのRPEにおける一次繊毛の形態と機能の理解に焦点を当てた研究はほんのわずかであり、数十年間無視されてきました。 一次繊毛はマウスの RPE 成熟に必須であり、標準的な Wnt シグナル伝達を調節することによって作用することが知られています 63。 RPE の一次繊毛は、BBSome タンパク質と標準的な Wnt シグナル伝達に依存して成熟後に吸収されることも知られています 64 が、マウス RPE の繊毛は成人期を通して保持されることが矛盾する報告によって示唆されています 82。 本研究では、アルビノマウスの一次繊毛レベルも発育段階の増加とともに減少することが判明し、Patnaikらの報告を裏付けている64。 さらに、有色C57BL/6マウスと比較して、アルビノマウスでは繊毛の退縮時間が遅いこともわかりました。 このことは、潜在的な光誘発性損傷プロセスを起こしやすいアルビノ網膜ではおそらく繊毛が残り、色素沈着したマウス網膜では容易に観察されない潜在的な修復プロセスに関与している可能性があることを示唆しました。 アルビノラットに関する以前の繊毛研究でも、出生後の段階で一次繊毛が発見されました65。 繊毛形成がメラノサイトのメラニン形成を負に制御することが示されています83。 あるいは、収縮時間の違いは、ひずみの違いによるものであるか、またはメラニン合成に直接関係している可能性があります。 BBS6 と BBS8 は、発生中のマウス RPE における繊毛の分解と RPE の成熟に関与していることが証明されています 64。 具体的には、BBS8 欠損 RPE は表現型の欠陥を示し、RPE の恒常性に影響を与えました 84。 ここで我々は、発生中の RPE 繊毛形成における BBS4 の重要な役割を示しました。 興味深いことに、以前の報告では、BBS8 または BBS6 が存在しないと、マウス RPE の繊毛と繊毛の長さの両方が損なわれることが示されています。 BBS4 ノックアウト RPE では毛様体長の変化は見つかりませんでした。 さらに、ヒトのRPEは成人になっても安定した繊毛レベルを保持していることもわかりました。 したがって、繊毛プロファイルの違いは、一次繊毛制御における種特異的な違いによって引き起こされる可能性があります。 興味深いことに、ヒト RPE 細胞は成人年齢でも安定した繊毛レベルを保持していることがわかりました。 繊毛プロファイルの違いは、一次繊毛制御における種特異的な違いによって引き起こされる可能性があります。 マウス RPE の一次繊毛は、この組織や網膜の発達における他の眼細胞において重要である可能性がありますが、マウスは黄斑を持たないため、成体 RPE の細胞機能には必要ありません。 対照的に、一次繊毛は成人のRPEには必須であるようですが、網膜疾患では機能不全に陥ります。 したがって、マウスは目の繊毛症の研究に最適なモデルを提供するとは考えられません。

創傷修復プロセス中に、病変を取り囲む上皮細胞が増殖および遊走して、創傷領域の表面を再表面化します60,85。 一次繊毛は創傷治癒中に大きな変化を受けると想定されており 58,60,86 、繊毛の組み立て/分解プロセスは損傷反応に深く関与していると考えられています。 角膜内皮細胞では、一次繊毛が機械的損傷に対する組織反応の初期段階で急速に再形成され、細胞の形態形成とパターン形成をナビゲートします 72。 創傷治癒が完了し、形態形成が安定すると、一次繊毛は再吸収されます。 たとえば、内耳の有毛細胞では、外傷後に成体の繊毛が再生します87。 腎臓の尿細管細胞では、腎臓の修復中に一次繊毛の長さが増加します88。 我々の現在のデータは、マウスRPEにおいて繊毛がレーザーによる創傷治癒中に急速に再構築され、修復プロセスが完了すると分解されることを示している。

以前の研究では、一次繊毛が細胞増殖と細胞周期に受動的に影響を与えることが示されています62,89。 繊毛は、細胞が細胞周期に再び入るときに分解し、細胞周期の G1/G0 期に再集合します。 一次繊毛が修復中にRPEの増殖を負に制御することは驚くべきことではありません。 本発明者らは、出生後RPEのためにIft88を枯渇させると、細胞増殖が促進され、創傷修復速度が促進されることを発見した。 根本的なメカニズムはさらに調査する必要がありますが、生体内でレーザー光凝固によって誘導されることが報告されているため、β-カテニン/Wnt 経路が少なくとも部分的に関与している可能性があります 73。

RPE 開発研究では、技術的な制限の 1 つは、マウスとヒトの RPE 組織の一次繊毛を視覚化するために 1 つの繊毛マーカー Arl13b のみを使用することでした。 この制限は、私たちのデータと他の出版物のデータ間の繊毛の違いを部分的に説明する可能性があります64。 さらに、後期成熟型 RPE Cre ドライバー BEST1 を使用して、マウス RPE から Ift88 を遺伝的に除去しました。 BEST1 プロモーターの発現は遅く起こるため、繊毛の除去は RPE の成熟と恒常性に限定的な影響を与える可能性があります。

結論として、この研究は、生体内での成人RPEにおける一次繊毛の役割についての洞察を提供します。 我々は、一次繊毛がRPE修復中に急速に再形成し、増殖を阻害することで創傷治癒を負に制御し、RPE変性疾患における潜在的な治療標的となることを示した。 また、ヒト RPE は成人になっても一次繊毛を発現し続けることも示しました。 これらの発見を総合すると、欠陥のある RPE 創傷修復の病因において一次繊毛が果たす役割についての理解が深まります。

一次抗体、供給源、カタログ番号、および希釈は次のとおりです。抗 Arl13b マウス (Antibodies Incorporated、N295B/66、1:2000)。 抗小帯閉塞-1 (ZO-1) ウサギ (Invitrogen、617300、1:350)。 抗Creマウス（ミリポア、クローン2D8、1:400）。 抗 RPE65 マウス (Abcam、ab13826、1:500)。 抗エズリンマウス (Millipore、E8897、1:500)。 抗 Ki67 マウス (Cell Signaling、9449 T、1:500)。 ローダミン ファロイジン (Invitrogen、R415、1:1000)。 二次抗体: AlexaFluor 488、647、および 594 IgG (Life Technologies、1:200)。 ProLong Gold Antifade Mount と DAPI は両方とも Invitrogen 製です。

CD-1 IGS マウスは Charles River Laboratory から入手しました。 Arl13b-mCherry。 Centrin2-GFP マウスは、The Jackson Laboratory から購入しました (Arl マウスと呼ばれる、ストック番号 027967)。 この二重トランスジェニック株は蛍光 mCherry と GFP を発現し、それぞれ毛様体タンパク質 (Arl13b) と基底体タンパク質 (Centrin2) を標識します。 RPE 特異的 Ift88 ノックアウト マウスは、floxed Ift88 マウス (The Jackson Laboratory ストック番号 022409) と BEST1-Cre トランスジェニック マウスを交配することによって作製されました 71。 マウスの遺伝子型を特定するための PCR は、記載されているように尾生検ゲノム DNA を使用して実行されました 90。 プライマーは次のとおりです:BEST1-Cre、フォワード: TCCGAAAAGAAAACGTTGATG; 逆: CCCGGCAAAACAGGTAGTTA; ヘテロ接合動物を野生型対照として使用した。 動物は、水と餌を自由に摂取できるように、12 時間の明暗サイクル下で飼育されました。 マウスを一晩暗所に適応させ、薄暗い赤色光下で CO2 吸入により安楽死させた。 眼を摘出し、冷ＰＢＳ中で解剖し、続いて新たに作製した４％パラホルムアルデヒド中で室温で１時間固定した。

BBS4 変異マウスおよびコントロールの眼は、Nicolas Berbari 博士 (インディアナ大学) から入手しました。 BBS4 の眼は、出生日 (P0) に突然変異体および対照野生型の子犬から採取され、4% パラホルムアルデヒド中で 4 °C で一晩固定され、冷 PBS に入れて出荷されました。

マウスをキシラジン(0.01 mg/g)とケタミン(0.08 mg/g)の混合物で麻酔し、続いてトロピカミド(Akorn, Somerset, New Jersey)とフェニレフリンで瞳孔を拡張した。 細隙灯システムを利用した 577 nm PASCAL レーザー (Topcon Medical Laser System, Inc.、カリフォルニア州サンタクララ) を使用して、マウスの目に単一レーザー病変を誘発しました 91。 レーザーパラメータは次のとおりです。典型的な出力は 70 mW、持続時間は 20 ms、空中スポット直径は 200 μm です。 6 つのレーザー スポットは、各スポットから少なくとも 1 mm の距離でマウスの網膜上に均等に分布しました。 レーザーエネルギーはRPE細胞の色素沈着によって吸収され、熱として網膜に放出され、その結果RPE細胞と光受容体細胞の両方が死に至ります。 治療の成功は、フルオレセイン血管造影ですぐに目に見える網膜の白化と漏出によって決まります。

マウスの瞳孔は、記載されているように、麻酔を投与する 10 分前にトロピカミドとフェニレフリンによって拡張されました 92。 ERG記録前にマウスを12時間暗順応させた。 ERG記録は、Celeris ERG刺激装置(Diagnosys LLC)を使用し、説明書に従って薄暗い赤色光の下で実施した。 簡単に説明すると、マウスを加熱パッドの上に置き、乾燥を防ぐために角膜表面に人工涙液を塗布しました。 2 つの ERG 電極を角膜表面に静かに置き、記載されているように Espion ソフトウェアによって光刺激を制御しました (バージョン 6; Diagnosys)70。 1 グループあたり 4 匹のマウスと、片目あたり 300 回の読み取りを記録しました。 この研究では 3 回の反復が行われました。

OCT イメージングは​​ ERG 記録の直後に実行されました。 記載されているように、角膜の水分を維持するために人工涙液を適用する前に、コンタクト レンズ (Advanced Vision Technologies) をマウスの角膜に配置しました 92。 OCT 画像は、Heidelberg Spectralis SLO/OCT システム (Heidelberg Engineering、ドイツ) を使用して取得されました。 網膜スキャンが取得され、視神経乳頭の周囲を中心とした画像と位置合わせされました。 感光体層の厚さは、サンプルの二重盲検マスキングによって測定され、ハイデルベルグソフトウェアによって平均化された。 RPE-cKO マウスの光受容体の厚さの平均を、対照としてのヘテロ接合マウスと比較しました。

RPE フラットマウント実験では、マウスを 6 時間暗順応させた後、眼を摘出しました。 網膜組織および前眼部（角膜、虹彩および毛様体、および水晶体）を、薄暗い赤色光の下で冷ＰＢＳ中で直ちに除去した。 次いで、ＲＰＥ／脈絡膜層を４％ＰＦＡ固定液に室温で１時間浸漬した。 固定した組織をPBSで3回洗浄し、10％ヤギ血清、0.3％Triton X-100を含むブロッキング緩衝液中で室温で1時間インキュベートした。 ブロッキング後、RPE/脈絡膜層を一次抗体とともに 4 °C で一晩インキュベートしました。 PBSで洗浄した後、組織を二次抗体を含むブロッキングバッファー中で室温で1時間インキュベートしました。 核をDAPI核染色剤405で染色した。ProLong Gold (Life Technologies)を用いてカバーガラス上にマウントする前に、アイカップの端から赤道まで8つの放射状の切り込みを入れた。 共焦点イメージングは​​、Zeiss LSM880 共焦点顕微鏡を使用して実行されました。

健康なヒトおよび加齢黄斑変性症のドナー眼の匿名化された組織サンプルは、カリフォルニア州パロアルトにあるスタンフォード大学病理学部から入手されました。 死後 48 時間以内に眼を採取し、除核後 4 °C の湿潤チャンバー内で保管しました。 角膜、虹彩、水晶体、および硝子体を、角膜輪部の３ｍｍ後方に作られた冠状切開を通して除去した。 グローブを 4% PFA で一晩固定し、1 × PBS で 4 °C で洗浄しました。 この目は、後眼部の病状を持たない患者のものでした。 約 6 ～ 8 mm2 の RPE の層が、顕微解剖技術を使用して平らになる前に網膜および脈絡膜から分離されました。

固定したヒト RPE 組織を PBS で 1 時間、次に 50% メタノール (PBS 中) で 1 時間、80% メタノールで 1 時間、および 100% メタノールで 1 時間 2 回洗浄しました。 次に、サンプルを 20% DMSO/メタノール中の 5% H2O2 で 4 °C で一晩漂白しました。 漂白後、サンプルをメタノールで 1 時間、次に 20% DMSO/メタノールで 1 時間 2 回、次に 80% メタノールで 1 時間、50% メタノールで 1 時間、PBS で 1 時間 2 回、最後に PBS で洗浄しました。 /0.2% Triton X-100 で 1 時間 2 回染色した後、さらなる染色手順を実行します69。

一次繊毛は、図1および2のArl13bシグナルに基づいてカウントされました。 1および2：非特異的バックグラウンドと区別するために、明確な線状構造を有する連続Arl13b陽性シグナルを一次繊毛としてカウントした。 具体的には、RPE フラットマウントを Zeiss LSM 880 共焦点顕微鏡を使用して 63 倍、0.6 倍の光学ズーム (223 × 223 μm2) で撮影しました。 画像は、非特異的染色による一次繊毛の特徴をより良く評価するために、Z スタック (0.3 μm 間隔) でキャプチャされました。 図 5 では、一次繊毛は 2 つの一次繊毛マーカー (Arl13b およびセントリン 2 シグナル) によって決定されました。

創傷サイズの測定のために、レーザー治療後 24 時間および 48 時間の RPE-cKO マウスおよび対照マウスのレーザー照射された RPE フラットマウント上の再上皮化を分析しました (サンプルグループを盲検化)。 この目的のために、抗ZO-1抗体またはファロイジンを利用して細胞境界を視覚化しました。 非上皮化領域のサイズは、FIJI ImageJ ソフトウェア（米国メリーランド州ベセスダ国立衛生研究所）を手動で補助しながら測定しました。 RPE-65 およびエズリン染色の蛍光強度の定量化は、推奨ガイドラインに従って Zeiss ソフトウェアを使用してピクセル強度を平均することによって計算されました。

すべての統計分析は、Graphpad8 (Prism) ソフトウェアを使用して実行されました。 結果は平均値±SEMとして表されます。 統計分析は、2 つのグループを比較するために対応のない t 検定によって処理されました。 0.05 未満の P 値は統計的に有意であると判断されました。

ヒトサンプルに関する私たちの研究は、ヒトを対象とした医学研究に関するヘルシンキ宣言の原則に従って行われました。 この研究はスタンフォード大学の治験審査委員会（IRB）によって承認されました。 この研究はARRIVEガイドラインに従って報告されています。 研究目的でのサンプルの使用については、事前に署名された書面によるインフォームドコンセントが権限のある法定代理人から受け取られています。 動物に関連するすべての手順は、視覚および眼科研究協会の眼科および視覚研究における動物の使用に関する声明のガイドラインに準拠しており、すべての動物実験は、米国の施設内動物管理使用委員会 (IACUC) によって承認されました。スタンフォード大学医学部。 BBS4 マウスのすべての手順は、インディアナ大学-パデュー大学インディアナポリスの IACUC によって承認されました。

現在の研究中に使用および/または分析されたデータセットは、合理的な要求に応じて責任著者から入手できます。

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貴重なアドバイスとサポートを提供してくださったダニエル・パランカー博士に感謝します。 ヒト RPE 組織を提供してくれた Ruwan A. Silva 博士。 Philip P. Prosseda 博士、Xiaowan Ma 博士、Biao Wang 博士、Qing Wang 博士に技術貢献していただきました。

この研究は、NIH/NEI K08-EY022058 (YS)、R01-EY025295 (YS)、R01-EY032159 (YS)、R01-EY-023295 (YH) R01-EY024932 (YH)、R01-EY025790 (DV) によってサポートされました。 、R01-DK114008 (NFB)。 VA 功績 CX001298 (YS)、ジーグラー盲人財団 (YS)、ショーウォルター財団 (YS)、児童健康研究所賞 (YS)。 失明予防のための研究無制限補助金 (スタンフォード眼科)、アメリカ緑内障協会 (YS)、ロウ症候群協会 (YS)、およびテンプル騎士団眼科財団 (YS)。 スタンフォード眼科への P30 ビジョン センター助成金 (P30EY026877)。 YS は、小児トランスレーショナル医学のローリー・クラウス・レイコブ学部奨学生です。 この研究は、NIH/NEI K99-EY34932 (KN)、国際網膜研究財団 (KN)、ブライトフォーカス財団 (KN)、および ARVO 旅行助成金 (KN) によっても支援されました。

スタンフォード大学医学部眼科、1651 Page Mill Road、Rm 2220、パロアルト、カリフォルニア、94304、米国

Ke Ning、Mohajeet B. Bhuckory、Chien-Hui Lo、Brent E. Sendayen、Tia J. Kowal、Ming Chen、Douglas Vollrath、Vinit B. Mahajan、Yang Hu & Yang Sun

パロアルト退役軍人局、パロアルト、カリフォルニア州、米国

ブレント・E・センダエン＆ヤン・サン

スタンフォード大学医学部遺伝学科、パロアルト、カリフォルニア州、米国

ダグラス・フォルラス

米国インディアナ州インディアナポリス、インディアナ大学・パデュー大学インディアナポリス生物学部

ルチ・バンサル & ニコラス・F・ベルバリ

ピッツバーグ大学医学部眼科、米国ペンシルバニア州ピッツバーグ

クンチェ・チャン

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KN, YS はすべての実験を設計、実行し、原稿を書きました。 MB はレーザー治療と原稿の編集に貢献しました。 BS はマウス系統の生成に貢献しました。 TK、CHL、MC は実験計画データの分析に貢献しました。 RS は BBS4 ヌルマウスの眼を提供し、分析を支援しました。 DV、NFB、KCC、VM、YH は、この研究に対して貴重なアドバイスと実験的な提案を提供してくれました。 YSはプロジェクト全体を監督しました。

楊孫氏への対応。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

シュプリンガー ネイチャーは、発行された地図および所属機関における管轄権の主張に関して中立を保ちます。

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転載と許可

ニング、K.、ブッコリー、MB、ロー、CH。 他。 網膜色素上皮における IFT88 によって媒介される繊毛関連の創傷修復。 Sci Rep 13、8205 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41598-023-35099-3

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受信日: 2022 年 12 月 6 日

受理日: 2023 年 5 月 12 日

公開日: 2023 年 5 月 21 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-35099-3

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