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Sep 12, 2023

さまざまな腸内微生物群集が定着したマウスのアテローム性動脈硬化に対する食物繊維の種類の影響を分析する

Biofilm e microbioma npj

npj Biofilms and Microbiomes volume 9、記事番号: 31 (2023) この記事を引用

4 オルトメトリック

メトリクスの詳細

食物繊維の摂取は心臓代謝の健康状態の改善と関連していますが、人体での研究では、観察された効果には大きな個人差があることが報告されています。 私たちは、アテローム性動脈硬化に対する食物繊維の効果が腸内微生物叢の影響を受けるかどうかをテストしました。 われわれは、3 人のヒトドナー (DonA、DonB、および DonC) からの糞便サンプルを無菌 ApoE-/- マウスに定着させ、5 種類の発酵性繊維 (FF) または非発酵性セルロース対照 (CC) の混合物を添加した餌を与えました。ダイエット。 DonA が定着したマウスは、CC を与えられたマウスと比較して、FF を摂取することでアテローム性動脈硬化の負担が軽減される一方、他のドナーからの微生物叢が定着したマウスでは繊維の種類がアテローム性動脈硬化に影響を及ぼさないことがわかりました。 DonA マウスの FF 給餌に関連する微生物の変化は、酪酸を生成する分類群の相対的存在量が高いこと、酪酸レベルが高いこと、ビタミン B の合成に関与する遺伝子が豊富であることを特徴としていました。 我々の結果は、FFに対する反応におけるアテローム保護は普遍的ではなく、腸内微生物叢の影響を受けることを示唆しています。

同じ食事や治療薬に対する個人の反応には一貫性がないことが多く、普遍的ではありません。 この概念は、精密医療と栄養学の基本原則です1,2。 遺伝学、食事、性別などの多くの要因が、被験者が特定の治療法にどのように反応するかに影響を与えます。 最近、腸内マイクロバイオームが、観察される応答性の対人変動に大きく寄与していることが明らかになりました 3,4,5,6。 腸内マイクロバイオームが健康に重要な役割を果たしており、その構成は個人によって大きく異なることが現在では広く認識されています7。 食品から経口投与される医薬品に至るまで、食事の成分は消化管内の常在微生物と密接に接触します。 腸内マイクロバイオームは、ヒトゲノムの 100 倍を超える遺伝子を集合的にコードしており、その中には摂取された化合物を代謝し、それらの生物学的利用能、活性、そして最終的には宿主への影響を調節する可能性のある豊富な酵素が含まれています 8、9、10。 実際、腸内細菌は、降圧薬から臓器移植用の免疫抑制剤に至るまで、生理活性化合物 11 に対する反応を調節する能力で近年かなりの注目を集めています 12,13。 どの介入がマイクロバイオームの変化に最も敏感であるかをより深く理解することは、精密医療を効果的に実施するために重要です。

心血管疾患（CVD）は米国の主な死因であり、世界全体の死亡者数の 3 分の 1 以上を占めています 14,15。 アテローム性動脈硬化症は CVD の最も一般的な症状であり、動脈壁内にマクロファージが密集した脂肪プラークの形成を引き起こす炎症過程によって引き起こされます 16。 腸内マイクロバイオームがアテローム性動脈硬化の進行の調節に重要な役割を果たしているという証拠が増えています。 疫学研究では、冠状動脈疾患を患う人のマイクロバイオームと健康な人との違いが特定されています17、18、19。 さらに、特定の食事成分から生じるいくつかの微生物代謝産物は、さまざまなメカニズムを通じてヒトおよび動物モデルのアテローム性動脈硬化の進行を調節することが示されています。 例えば、コリンの微生物誘導体であるトリメチルアミン N-オキシドは、ヒトにおける主要な心血管イベントのリスク増加と関連しています 20。 トリプトファンに由来する微生物の代謝物であるインドール-3-プロピオン酸は、コレステロールの流出を促進することによってアテローム性動脈硬化の進行を防ぎます21。 食物繊維の発酵によって生成される短鎖脂肪酸（SCFA）は、食事からのコレステロール吸収（プロピオン酸）を制限し、炎症と腸透過性（酪酸）を軽減することにより、アテローム性動脈硬化を改善することが示されています22、23、24。 実際、食事がアテローム性動脈硬化症の促進と予防の両方に大きな役割を果たすことは長い間知られてきました 25,26。 たとえば、食物繊維が豊富な全粒シリアルや豆類などの食品が CVD から保護することは十分に確立されています 27,28。 しかし、CVD に対する多くの食事療法および薬理学的介入に対する反応の一貫性が個人間で観察されています 29,30。 食物繊維と心血管の健康状態の改善を結び付ける研究のほとんどは、母集団の平均値を使用して評価されており 31、個人の特性は考慮されていません。 したがって、これらの不一致の背後にある原因は十分に研究されていません。

食物繊維は、宿主酵素による分解に抵抗するオリゴ糖または多糖であり、遠位腸内の微生物によって代謝されます。 食物繊維は構造と組成が大きく異なり、多くの場合、生化学的特性に従って細分化されます。 そのような区分の 1 つは、腸内微生物によって発酵できるかどうかによって決まります。 したがって、発酵性繊維は腸内微生物によって代謝される食物繊維であるのに対し、非発酵性繊維は腸内発酵に抵抗します 32。 この定義によると、発酵性は特定の繊維の静的または固有の特性ではなく、状況に依存し、問題の繊維を分解する可能性のある特定の微生物の存在や宿主環境（輸送時間、反芻など）に左右されるためです。 。 胃腸管内で食物繊維が発酵すると、SCFA が生成されます。SCFA の中で最も豊富なのは酢酸塩、プロピオン酸塩、酪酸塩です。 SCFA は心臓代謝の健康状態の改善と関連付けられており 22,23、食物繊維の摂取に関連するアテローム保護効果の一部を媒介すると仮説が立てられています 33。 しかし、SCFAの産生はマイクロバイオームの構造に依存しており、個人差が大きいことが複数の研究で示されています。 たとえば、McOrist et al. らは、レジスタントスターチ（RS）栄養補助食品に対する酪酸生成における個別の反応を発見しました34。 さらに、我々は最近、さまざまな発酵性繊維（ペクチン、イヌリン、フラクトオリゴ糖（FOS）、RS-2、およびRS-4）が、異なる微生物群集が定着したマウスに給餌された場合、SCFA産生において異なる反応を誘発することを発見しました35。

腸内マイクロバイオームの個人化された性質と、腸内微生物が食物繊維の代謝に必要であるという事実を考慮すると、特定の食物繊維に反応して得られるアテローム保護効果は、消費者の腸内マイクロバイオーム組成によって調節されるという仮説を立てました。 これをテストするために、我々は、無菌（GF）アポリポタンパク質E欠損（ApoE-/-）マウスのグループに、3人のヒトドナーのうちの1人からの糞便微生物群集を定着させた。各群は、異なる微生物組成とSCFA産生能力を示した。 定着したマウスには、発酵性繊維の混合物（FF）または非発酵性セルロース対照食（CC）のいずれかを含む食餌を与えました。 私たちは、FF摂取によるアテローム性動脈硬化からの保護は普遍的ではなく、常在微生物叢によって調節されることを発見しました。 また、アテローム保護が酪酸生成の増加と、炭水化物代謝とビタミン合成の経路に関与する細菌遺伝子の濃縮と関連していることも観察しました。

無菌（GF）雌ApoE-/-マウスに、3人のヒトドナーのうちの1人からの糞便サンプルをコロニー形成させた（補足図1）。 これらのサンプルは、70 代半ばの成人から以前に収集された糞便検体のリポジトリから選択され 36、(i) 16S rRNA プロファイルの重み付けされていない UniFrac 距離によって評価された多様なコミュニティ構造、および (ii) 異なる生成能力に基づいて選択されました。各種繊維を含む半精製飼料を摂取した GF マウスに移植した場合の SCFA レベル 35。 コロニー形成後、食餌療法段階の前に移植されたコミュニティの安定化を可能にするために、マウスをFF食で2週間維持しました（補足図1）。 この時点で糞便サンプルを収集し、16S rRNA V4 アンプリコン配列決定を通じて細菌の生着を評価しました。 生着効率（属レベル）は、DonA 定着マウスではそれぞれ 64%、DonB 定着マウスでは 65%、DonC 定着マウスでは 72% でした（補足図 2f）。 レシピエントマウスの少なくとも1匹で検出されたドナー属の割合として計算すると、効率はDonA、DonB、およびDonCコロニー形成マウスでそれぞれ90、88、および87％でした（補足図2c〜e）。 これらの生着効率は以前の研究と一致しています 37,38。 ヒトのドナーとレシピエントマウスの間の生理学的、解剖学的、行動的な違いと食事の違いが、なぜドナーの細菌の一部しか生着しないのかを説明している可能性があります。

いくつかの属はレシピエントマウスでのみ検出されたが、3 つのドナーグループのそれぞれに固有であり、これらの分類群は汚染の結果ではなく、ヒトドナーサンプル中に低濃度で存在した可能性があることを示唆しています。 食餌療法前に採取した糞便サンプルの加重 UniFrac 距離の主座標分析 (PCoA) では、すべての治療群内で 2 つの食餌 (FF 結合および CC 結合) に結合したマウス間で均一な生着が示されました (すべてペアワイズ PERMANOVA 調整 P > 0.1、補足図2a)。 ただし、重み付けされていないUniFrac距離（分類群の存在/不在に敏感）を使用した比較では、FF結合コミュニティとCC結合コミュニティの間でDonAコロニー形成マウスのコミュニティ構造に有意な違いが示されました（調整後P = 0.0012、補足図2b）。 これは、一方の食餌制限グループでは検出されたが、もう一方のグループでは検出されなかった9つの属によって推進されました（補足図2c）。 食事療法の 11 週間後、盲腸サンプルが収集され、終末微生物群集を評価するために使用されました。 実験の終了までに、欠落していた9つの属のうち5つは、どちらの食餌を与えたマウスの盲腸内容物からも検出されなくなりましたが、4つの属（クロストリジウム属、フェカリバクテリウム属、ゲミガー属、および未確認のルミノコッカス属）はFF給餌マウスでのみ検出されました。 (補足図2c)。 これは、DonA マウスの食餌グループ間で集合したコミュニティで観察された差異が、食餌の影響ではなく一貫性のない生着の結果である可能性を導入します。 あるいは、微生物群集は定着後の期間にかなりの変動を受けるため 39、これらの欠落分類群が CC 結合マウスに存在していても、検出可能なレベル未満である可能性があります。 後者のシナリオは、(i) すべての DonA マウスへの接種に使用されたヒトドナーサンプルから、欠落している分類群のすべてが検出されたこと、(ii) 同様の FF 食餌によるパターンが、マウスのフェカリバクテリウム属およびゲミガー属の存在量で観察されたという事実によって裏付けられています。同じドナーの糞便と同じ食事を使用した以前の研究35。 これらの発見は、結論を適切に文脈化できるように、マウス移植研究における治療前の生着データを報告することの重要性を強調しています。

コロニー形成の 2 週間後、マウスを食餌治療グループに配置し、それぞれの食餌で 11 週間維持しました。 研究の完了時に評価された盲腸細菌群集の加重および加重されていないUniFrac距離のPCoA分析（図1a、b）は、各ドナーグループ内でマウスが食事療法によって高度に区別できることを示しています。 重み付けされていないUniFrac距離を使用した場合、叙階により、ドナーグループが食事よりもコミュニティの構成に強い影響を与えていることがわかります（図1a）。 各分類群の存在量を考慮した重み付けされたUniFrac距離のPCoAは、食餌による明確な違いを示していますが、ドナーグループ間ではより多くの重複があり（図1b）、FF消費がいくつかの低存在量の系統発生的に関連した分類群の明確な変化を誘発することを示唆しています3 つのコミュニティ全体で。 アルファ多様性（シャノン）は、CC消費と比較して、FFを消費するDonAが定着したマウスの方が高かったが、DonBまたはDonC定着マウスでは食事による有意な影響は受けませんでした（図1f）。 同様に、観察されたアンプリコン配列バリアント（ASV）の豊富さは、DonA マウスの FF 食餌により大幅に増加しましたが、DonB マウスの FF 食餌により減少しました（図 1g）。 FF摂取により、CC給餌マウスと比較して、微生物バイオマスの代用である盲腸内容物のDNA濃度が増加しました40（補足図3）。 この効果は 3 つのドナー グループすべてで観察され、発酵性繊維が豊富な食事は一般に微生物バイオマスを増加させることを示唆しています。

a、b 16S rRNA V4 ASV の重み付けされていない UniFrac 距離と重み付けされた UniFrac 距離の主座標分析。 動物には、DonA、DonB、および DonC の 3 つの異なるドナーからの糞便サンプルが定着しました。 c 2つの食餌の属レベルの分類群の相対存在量（下のX軸、色付きのバー）と食餌間の差分存在量（MaAsLin 2）の効果サイズ（上のX軸、点）。 各ドナーグループ内の分類群の存在量の有意な差は黒点で示され（調整済み P < 0.1）、白丸は有意な変化がないことを示します（調整済み P > 0.1）。 原点に対するドットの方向は、各分類群の存在量に対する食事の影響を表します (負の値は CC 存在量に対応し、正の値は FF 存在量に対応します)。 各分類群を含むファミリーの最初の 5 文字が括弧内に示されています。 科が不明な場合は、代わりに分類群がリストされ、「P-」が付けられます。 d 食餌およびドナーグループの関数としての、門レベルの分類群の相対的な豊富さ。 e バクテロイデテス対ファーミクテスの比。 f、g シャノンの多様性指数と観察された豊かさ。 箱ひげ図は、個々のデータ ポイントとともに、四分位範囲の 1.5 倍以内の点の四分位範囲、中央値、広がりを示します。 マゼンタ = 発酵性繊維 (FF)、青 = セルロース コントロール (CC)。 ウィルコクソン検定で実施された平均値の比較 (n = 7 ～ 10/食事/ドナーグループ)、*P < 0.05、**P < 0.01、***P < 0.001。

細菌群集はファーミクテス属とバクテロイデテス属が優勢であり、すべての治療グループで検出可能なレベルのプロテオバクテリアとベルコミコルビアが存在しました（図1d）。 放線菌は、FF 給餌 DonA 定着マウス、CC 給餌 DonB 定着マウス、および DonC 定着マウスの両方の食餌で検出されました。 FF給餌により、すべてのドナーグループのバクテロイデス属対ファーミクテス属の比が低下しました（図1e）が、唯一の有意な低下はDonA定着マウスで観察されました。 門レベルの変化を考慮した場合でも、ドナーグループ全体で観察された食事に関連した濃縮パターンには一般に一貫性がほとんどなく、食事療法に対する普遍的な反応の欠如を示唆しています（図1c-g）。

我々は、マイクロバイオーム多変数線形モデル (MaAsLin 2)41 を使用して、各ドナー グループの食事によって引き起こされる属レベルでの濃縮パターンを分析しました。 有意に異なっていたほとんどの属（調整済み P < 0.1）は、各ドナー グループに固有でした。Blautia は、すべてのドナー グループにわたって FF 摂取によって有意に富化された唯一の属であり、一方、Eggerthella、Butyricimonas、および Parabacteroides は、その影響を示した唯一の属でした。 CC食に応じた普遍的な栄養強化（図1c）。 普遍性の欠如についての明白な説明の 1 つは、各ドナー グループが異なる微生物のコレクションを所有しているという事実です。 ただし、複数のドナーにわたって存在する属の場合でも、食餌に対する反応の方向性はコミュニティによって異なる傾向がありました（[ラクン] クロストリジウム、バクテロイデス、アッカーマンシア、[ラクン] 未定、[ルーミン] クロストリジウム、オシロスピラ、[エリシ] ］クロストリジウム、［ラクーン］ルミノコッカス）。 例えば、バクテロイデス属は、DonC定着マウスにおけるCC給餌によって、DonB定着マウスにおけるFF給餌によって有意に濃縮され、DonA定着動物においては食餌の影響を受けなかった(図1c)。 興味深いことに、アッカーマンシアの相対存在量は、DonB マウスでは CC 給餌により、DonC マウスでは FF 給餌により有意に増加しましたが、DonA 定着マウスでは食餌の影響を受けませんでした。 この属で最も蔓延している種であるアッカーマンシア ムシニフィラは、繊維分解細菌によってグリコシル化される宿主ムチンを餌とするため、アッカーマンシア レベルに影響を与えます 42,43。 アッカーマンシアは発酵性繊維の少ない食事で生育すると報告されていますが44、我々のデータは微生物叢の組成が特定の繊維源に対するアッカーマンシアの反応に影響を与える可能性があることを示しています。 また、異なるドナーグループが、それ自体が食事によって異なる影響を受ける異なる株のアッカーマンシア・ムシニフィリアを保有している可能性もあります。 これらの結果を総合すると、食物繊維に対する微生物の反応は状況に依存しており、より広範な集団の構成と代謝能力の影響を受ける可能性が高いことが示唆されます。

DonA が定着した FF 給餌マウスでは、CC 給餌マウスと比較してアテローム性動脈硬化プラークの脂質沈着が大幅に減少し、プラーク面積が減少する傾向が見られました (P = 0.070)。一方、DonB または DonC 給餌では食餌間に差は観察されませんでした。定着したマウス（図2a〜c）。 アテローム性動脈硬化症の疾患状態をさらに特徴付けるために、MOMA-2 抗体を用いた免疫組織学によって病変のマクロファージ浸潤を評価しました。 いずれのドナーグループでも病変MOMA-2密度の食餌間で統計的に有意な差は観察されませんでしたが（図2a、d）、DonAマウスではFF給餌により密度が低下する傾向がありました（P = 0.11）。 以前の研究では、マウスのアテローム性動脈硬化に対するイヌリン (FF 食の構成繊維) の効果に関して一貫性のない結果が報告されています 45,46。 Rault-Nania et al. Hovingらは、イヌリンがApoE-/-マウスのアテローム性動脈硬化を改善することを発見したが、HovingらはイヌリンがAPOE*3-Leidenマウスのアテローム性動脈硬化を悪化させることを発見した。 この矛盾は、これらの研究で使用された食餌および/またはマウスモデルの違いによるものである可能性がありますが、我々の結果は、腸内微生物叢が発酵性食物繊維のアテローム保護効果を調節するという考えを裏付けており、これらの矛盾する発見の説明の可能性を提供しています。

アテローム性動脈硬化は、ヒト糞便群 DonA、DonB、および DonC に定着し、発酵性繊維食またはセルロース対照食のいずれかを与えられた GF ApoE-/- マウスで測定されました。 a 大動脈洞の断面内容の代表的なオイルレッド O 染色と MOMA-2 抗体染色。 プラーク平均面積 (b)、脂質陽性面積 (c)、または MOMA-2 陽性面積 (d) の定量化。 総コレステロール (e)、HDL コレステロール (f)、およびトリグリセリド (g) の血漿レベル。 箱ひげ図は、個々のデータ ポイントとともに、四分位範囲の 1.5 倍以内の点の四分位範囲、中央値、広がりを示します。 マゼンタ = 発酵性繊維 (FF)、青 = セルロース コントロール (CC)。 各ドナーグループ内の食餌間の平均値の比較（n = 7～10/食餌/ドナーグループ）は、等分散仮定に対する適切な補正を行ったウィルコクソン検定（Levenes 検定）を使用して実施されました、*P < 0.05、**P < 0.01 。

発酵性繊維の摂取により循環中の脂質組成が変化するかどうかをテストするために、上記のマウスの血漿中の脂質レベルを測定しました。 どのドナーグループでも、総コレステロール、HDLコレステロール、またはトリグリセリドの血漿レベルにおいて食事間に統計的な差異は観察されませんでした（図2e-g）。 また、コレステロール逆輸送のマーカーとしてRT-qPCRによってAbca1およびAbcg1 mRNAの大動脈発現レベルを評価しましたが、どのドナーグループでも食事間に統計的に有意な差は観察されませんでした（補足図4d、e）。 これらの結果は、DonA マウスで観察された FF 摂取のアテローム保護効果が、血漿脂質やコレステロール恒常性の大きな変化によって媒介されなかったことを示唆しています。 アテローム保護が血管の炎症状態の変化と関連しているかどうかを調べるために、アテローム性動脈硬化の進行に一般的に関連する炎症マーカー Tnf-α、Il1-β、および Vcam-1 の大動脈発現を測定しました 22,47。 どのドナーグループでも、食事間でこれらのマーカーの発現に有意差は観察されませんでした（補足図4a〜c）。 これらのデータは、DonA マウスにおける FF 給餌のアテローム保護効果がこれらの免疫プロセスやコレステロール逆輸送とは独立している可能性があることを示唆していますが、これらの要因を完全に除外するにはさらなる分析が必要です。

食餌間のマイクロバイオーム組成のばらつきを考慮して、次にドナーグループ間で繊維発酵能力に違いがあるかどうかをテストしました。 上記のマイクロバイオーム組成パターンと一致して、SCFAプロファイルの食事誘発性の変化はドナーグループに大きく依存していました（図3a〜d）。 最も豊富なSCFAである酢酸塩は、DonAおよびDonBコミュニティの両方が定着したFF給餌マウスで増加しました（図3a）。 プロピオン酸塩は、DonA マウスにおいてのみ FF 給餌によって増加しましたが、他の 2 つのドナー グループでは食事はプロピオン酸塩レベルに影響を与えませんでした (図 3b)。 FF給餌により、DonAマウスの盲腸酪酸レベルが大幅に上昇しましたが、CC給餌対応マウスと比較して、DonB定着マウスでは酪酸レベルが低下しました（図3c）。 DonC 定着マウスの盲腸酪酸濃度は食餌間で差がありませんでした。 分岐鎖脂肪酸のイソ酪酸とイソ吉草酸は、主にタンパク質発酵によって生成されますが、どのドナーグループでも食事の影響を受けませんでした（図3e、f）。 分岐鎖脂肪酸に違いがないことは、FF 食と CC 食が等タンパク質であるという事実と一致しています。 ドナーグループ内の総SCFA濃度（すなわち、酢酸塩、プロピオン酸塩、酪酸塩の合計）は、DonAおよびDonBではFF給餌によって増加しましたが、DonCでは増加しませんでした（図3d）。 これらの結果は、SCFA を産生する微生物叢で観察された変化を反映しています。 DonA マウスの FF 給餌によって増加した属の中には、クロストリジウム属、オシロスピラ属、ルミノコッカス属、ゲミガー属、およびフェカリバクテリウム属のみがあり (図 1c)、これらはすべて酪酸生成種を含んでいます 48,49。 注目すべきことに、これらの属のほとんどは他のドナーグループにも存在していましたが、FF給餌によって濃縮されませんでした。 これは、食物繊維に対する個々の属の反応に影響を及ぼす複雑な群集レベルの相互作用（例えば、競争）、または食餌に対する反応における株レベルの違い、またはその両方によるものである可能性がある。

酢酸塩（a）、プロピオン酸塩（b）、酪酸塩（c）、総SCFA（酢酸塩、プロピオン酸塩、酪酸塩の合計）（d）、イソ酪酸塩（e）およびイソ吉草酸塩の盲腸レベル（f）。 濃度は盲腸内容湿重量のグラム当たりで表されます。 箱ひげ図は、個々のデータ ポイントとともに、四分位範囲、中央値、および四分位範囲の 1.5 倍以内の点の広がりを示します。 各ドナーグループ内の食餌間の平均値の比較（n = 7〜10/食餌/ドナーグループ）は、ウィルコクソン検定を使用して行われました、*P < 0.05、**P < 0.01、***P < 0.001。

我々のデータは、マウスのアテローム性動脈硬化に対する酪酸誘導性保護が、血漿脂質レベルに大きな変化がない場合に起こることを示唆する、以前に報告された研究と一致している 22,24。 我々の結果と同様に、Kasahara ら 22 は、単純化された細菌群集が定着したマウスに酪酸生成微生物を導入すると、コレステロール恒常性の有意な変化を伴うことなく、ApoE-/- マウスのプラーク負荷とマクロファージ浸潤が減少したと報告しました。 しかし、笠原らは、 また、我々の研究では観察されなかった、炎症マーカー Tnf-α、Il1-β、および Vcam-1 の大動脈発現における酪酸誘発性の減少も検出されました。 さらに、最近の研究では、プロピオン酸塩の摂取が腸内でのコレステロールの取り込みを阻害することによりアテローム性動脈硬化を防ぐことがわかりました23。 FF食を摂取したDonA定着マウスでは盲腸のプロピオン酸塩レベルの上昇が観察されましたが、血漿コレステロールレベルの違いは検出されませんでした。 プロピオン酸塩が蓄積する胃腸管内の濃度と部位（つまり、経口摂取した場合は小腸での濃度が高いのに対し、繊維発酵で生成した場合は大腸での濃度が高い）は、コレステロール吸収に対するその効果に影響を与える可能性があります。 まとめると、これらの発見は、SCFA 生産能力が、利用可能な食物繊維と微生物群集の構成の両方に依存していることを示唆しています。 これらの結果はまた、酪酸塩を生成する微生物の豊富さが盲腸の酪酸塩レベルと関連しているという考えを裏付けています。

次に、微生物のメタゲノムプロファイルの変化を調べることにより、マイクロバイオームの機能的可能性とアテローム防御の間の関連性を特定しようとしました。 盲腸内容物から単離した DNA のショットガン シーケンスを実行しました (平均 2,940 ± 777 万ペアエンド リード/サンプル; n = 5/食事提供グループ)。 配列データを HUMAnN3 で分析し、各マウスの KEGG オルソロジー (KO) 存在量を含むメタゲノム機能プロファイルを生成しました。 ブレイ・カーティスの非類似性を使用したKOプロファイルの階層的クラスタリングは、治療群が互いに異なることを示していますが、クラスタリングパターンに対する食事の影響はドナーによって異なりました（図4a）。 DonA および DonC コミュニティが定着したマウスは、ドナー グループよりも食餌により密集しており、これら 2 つのドナー グループ間の KO プロファイルにおける FF の影響による有意なレベルの重複が示唆されました。 一方、DonB マウスは他のすべてのマウスとは別にクラスター化されましたが、食餌によってサブクラスター化されました (図 4a)。 各ドナー グループ内の FF 給餌マウスと CC 給餌マウス間の個々の KO の存在量の差を MaAsLin 2 で計算しました。この分析により、少なくとも 1 つのドナー グループ (DonA = 971) の食餌間で 2,676 個の KO が有意に異なっていることが明らかになりました (調整済み P < 0.05)。 ; DonB = 1964; DonC = 1419)。 これらのうち、すべてのドナー グループにわたって FF 給餌によって強化されたのは 67 人 (2.5%) のみでしたが、すべてのドナー グループにわたって CC 給餌によって強化されたのは 79 人 (3%) であり、食餌による機能プロファイルの変化のほとんどが、ドナー固有。 DonA および DonC 定着マウスは 326 で最も FF に富む KO を共有し、一方 DonA および DonB 定着マウスは 99 を共有し、DonB および DonC 定着マウスと定着した動物は 81 の KO を共有しました。

各マウスのCPMで表されたKOプロファイルのヒートマップ。 個々のプロファイルは、スピアマン階層クラスタリング手法を使用してクラスタリングされました。 b 過剰に発現したKEGG経路とその重要性（濃縮P値のlog10として表される）は、有意に上方制御された各ドナーグループのKOのリストを使用した経路濃縮分析によって特定されました（MaAsLin 2の差次存在量、調整済みP < 0.1）。 c 葉酸生合成およびコバラミン（ビタミンB12）生合成に関与するKOのMaAsLin 2の差次存在量（下軸、色付きバー）および効果サイズ（上軸、実線=調整済みP <0.1、白点=調整済みP > 0.1）。 負の値は、CC 給餌マウスの KO 存在量 (CPM) と CC 条件に有利なエフェクト サイズ (MaAsLin 2 係数) を反映し、正の値は FF 条件での KO 存在量とエフェクト サイズを示します (n = 5/食餌/ドナー グループ)。

次に、食事療法が各ドナーグループの盲腸微生物群集の代謝経路にどのような影響を与えるかについて、さらなる洞察を得ることを目的としました。 私たちは、DonA における FF 摂食に関連するアテローム保護の説明に役立つ可能性のある経路を特定することに特に興味を持っていました。 我々は、MicrobiomeAnalyst KEGG 経路ツール 50 を使用して、CC 食を摂取している対応者と比較して FF 給餌が過剰に存在する KO における経路濃縮分析を実施しました。 上で議論した分類結果と同様に、食事に応じたメタゲノム変化には普遍性が欠如していることが観察されました。 少なくとも 1 つのドナー グループにおける FF 給餌によって有意に過剰発現 (調整 P < 0.1) として検出された 38 の KEGG 経路のうち、3 つの経路 (ピルビン酸代謝、アミノ糖およびヌクレオチド糖の代謝、アミノ酸の生合成) のみが全体で観察されました。 3 つのドナー グループすべて (図 4b)。 DonA 定着マウスでは、CC 食と比較して FF 食で 27 の経路が有意に過剰に存在しました。 これらには、ビタミン合成 (チアミン生合成、葉酸生合成、ポルフィリン代謝 [ビタミン B12])、SCFA 合成 (ブタン酸代謝、プロピオン酸代謝)、およびアミノ酸代謝 (リジン生合成、システインおよびメチオニン代謝、ヒスチジン代謝、フェニルアラニン、チロシンとトリプトファンの生合成、バリン、ロイシン、イソロイシンの生合成、グリシン、セリン、スレオニンの代謝、アミノ酸の生合成）（図4b）。 興味深いことに、経路の強化に対する食事の影響には、酢酸（炭素代謝、グリオキシル酸とジカルボン酸の代謝、ピルビン酸の代謝）、プロピオン酸（プロピオン酸の代謝）、および酪酸（ブタン酸の代謝）の合成が含まれており、記載されている盲腸のSCFAレベルと非常に密接に対応していました。上（図4bおよび3a〜c）。

葉酸とビタミン B12 は両方とも、心臓血管疾患に関連しているメチオニン代謝の代謝物であるホモシステインの解毒に関与しています 51,52。 高ホモシステイン血症の ApoE-/- マウスを対象とした研究では、葉酸、ビタミン B12、ビタミン B6 の混合物を補給するとアテローム性動脈硬化を防ぐことがわかりました 53。 さらに、ヒトを対象とした最近のメタゲノム研究では、CVD 患者 (n = 218) では、健康な患者 (n = 187) よりも葉酸生合成経路の構成要素をコードする遺伝子の量が減少していることが示されました 17。 興味深いことに、その研究の著者らは、CVD がプロピオン酸および酪酸合成遺伝子の存在量の低下と関連していることも発見しました。 これらの経路のメタゲノム動態をより詳細に把握するために、葉酸生合成 (KEGG map00790) と嫌気性コバラミン (ビタミン B12) 生合成 (KEGG M00924) に関与する個々の KO の存在量の違いを比較しました。 我々の濃縮分析と一致して、両方の経路で差次的に豊富なKOのほとんどは、DonA定着マウスではFF給餌によって有意に上方制御されましたが、他のグループでは上方制御されませんでした（図4c）。 葉酸とビタミンB12は、FF食とCC食に同じ含有率で供給されましたが（AIN-93ビタミン混合物、補足表1）、微生物の生合成を介して利用可能な追加のビタミンが宿主に生理学的影響を与える可能性があります。ホモシステインの代謝。 これらの結果は、ビタミンB12と葉酸の微生物の生産が、この群集に定着したマウスのFF食に関連するアテローム保護の潜在的なメディエーターとして機能する可能性があることを示唆しています。

アテローム保護と線維代謝の関連性を明らかにするために、盲腸のメタゲノムデータを使用して、各ドナーグループ内の食事療法間の炭水化物活性酵素（CAZyme）ファミリーのレベルと種類を決定しました。 すべてのドナーグループに非常に豊富で、食事の影響をほとんど受けない多数のCAZymeファミリーを検出しました（図5a、b、補足図5）。 差次的な存在量分析により、食事によって最も顕著な影響を受けたCAZymeファミリーは、最も存在量の高いCAZymeよりも約100倍低いことが明らかになりました（図5c）。 治療群間の盲腸SCFAレベルの違いを考慮すると、これは、これらの高度に差があり、存在量が少ないCAZymeがSCFA代謝の動態に大きな影響を与えていることを示唆しています。 最も異なって豊富なCAZymeファミリーを強調するために、食事の影響を最も受けたCAZymeファミリーの存在量を比較しました（各ドナーグループ内のMaAsLin 2効果サイズによる上位10％、図5c）。 DonA定着マウスにおけるFFに富むCAZymeの大部分は、盲腸の酪酸レベルと有意に相関しており（スピアマン、P < 0.05）、酪酸生産と潜在的に関連している（図5c）。 そのような CAZyme ファミリーの 1 つである GH59 には、ペクチンのガラクタン側鎖から末端 β-D-ガラクトース モノマーを遊離させる β-ガラクトシダーゼが含まれています54。 興味深いことに、イヌリン、ペクチン、RS-2/4、および scFOS に関与する一般的に引用される CAZyme ファミリーの多くは、我々のデータセット内で最も差異的に豊富な CAZyme の中には見つかりませんでした。 複数の発酵性繊維を含めることで、各繊維タイプに特化した微生物間で競合が生じ、繊維特異的な CAZyme で検出される変化の規模が減少する可能性があります。

カテゴリ別（グリコシドヒドロラーゼ = GH、グリコシルトランスフェラーゼ = GT、炭水化物結合モジュール = CBM、炭水化物エステル = CE、および多糖リアーゼ = PL）に整理された CAZyme ファミリー プロファイルのヒートマップと、各 CAZyme ファミリーの平均数（カウントあたり） -百万（CPM）。 マウスのプロファイルは、Spearman 階層クラスタリング法を使用してクラスタリングされました。 b ドナーグループごとの食事間のCAZymeファミリーの豊富さ（各CAZymeカテゴリー内で検出されたCAZymeファミリーの総数）の比較。 棒グラフは、個々のデータ ポイントの平均を示します。 食事グループ間の平均値の比較は、ウィルコクソン検定を使用して実施されました。 *P < 0.05、**P < 0.01。 c MaAsLin 2の最も差異的に豊富なCAZymesの上位10％の差異的存在量（下軸、色付きバー）および効果サイズ（上軸、実線=調整済みP < 0.1、白点=調整済みP > 0.1）（n = 5/食事） /ドナーグループ）。 右側のパネルは、すべてのマウスにおける対応する各 CAZyme ファミリーと盲腸 SCFA レベルの間のスピアマン相関係数のヒートマップを示しています (*P < 0.05)。

要約すると、我々は、さまざまなヒト糞便群集に定着したノトバイオティクスApoE-/-マウスにおいて、腸内マイクロバイオームがアテローム性動脈硬化の発症に対する食物繊維の影響を調節していることを示した。 われわれは、微生物組成、代謝能、代謝産出量（SCFA）の食餌による変化が異なるドナーグループ間で異なることを発見した。 私たちの結果は、アテローム保護が盲腸の酪酸レベルの増加と酪酸生成微生物の豊富さに関連していることを示しました。 さらに、ショットガンメタゲノムシーケンスにより、炭水化物代謝、SCFA産生、ビタミン合成に関与する遺伝子のドナー依存性の変化が明らかになりました。 これらのデータは、食事に関連した腸内微生物叢の変化は食事だけの機能ではなく、食事とより大きな腸内微生物群集の構造および機能ネットワークとの間の複雑な相互作用の結果であるという概念を裏付けています。 これらの結果は、酪酸がコレステロール代謝を変化させることなくアテローム保護作用があることを示した以前の研究とも一致しています 22,24。

現在の研究には、対処すべきいくつかの制限があります。 まず、ヒトドナーからマウスレシピエントへの生着効率が不完全であることを観察しました。 上で論じたように、本発明者らは、DonA マウスの治療前の生着パターンの違いを検出した。 我々のデータは、この検出の違いは、定着後すぐ（2週間）の微生物群集の確率論の結果である可能性が高く、接種や汚染の違いの結果ではないことを示唆しています。 それにもかかわらず、この矛盾は、DonA マウス内のアテローム性動脈硬化で観察された差異が、食餌への反応ではなく一貫性のない生着によるものである可能性をもたらします。 もう1つの制限は、私たちの研究では3人のヒトドナーのみを使用したことです。 これらの食事に対する心臓代謝反応の幅広さを十分に理解するには、より大規模でより多様なドナー集団が必要となるが、ここで使用した限定されたグループは、食物繊維のアテローム調節効果が微生物叢に依存していることを実証するには十分である。 この研究はさらに、メスのマウスのみを使用するという制限があり、性別の影響をテストすることができません。 最後に、この研究で使用された CC 食と FF 食はデンプン含有量がわずかに異なり、これが上記の違いに寄与している可能性があります。

これらの制限にもかかわらず、ここで提示された研究は、マイクロバイオームの変動が食物繊維摂取に対する反応を調節し、それがアテローム性動脈硬化症の発症に異なる影響を与える可能性があることを示唆しています。 これらの結果を総合すると、食事介入は普遍的に効果があるわけではなく、個人に合わせて調整する必要があるという考えが裏付けられます。 関連するメカニズムや、マイクロバイオームに依存した食事に対する個人の反応を支配する代謝および生態学的動態を理解するには、さらなる研究が必要です。

現在の研究におけるすべての動物は、ウィスコンシン大学マディソン校の動物福祉基準に従って取り扱い、維持され、すべてのプロトコルは大学の動物管理使用委員会によって承認されました。 無菌 (GF) ApoE-/- マウス (B6.129P2-Apoetm1Unc/J 由来 GF; Jax 002052) を、12 時間の明暗サイクルの下、ノトバイオティクス アイソレーター内の制御された環境で飼育し、オートクレーブ処理した水と餌を与えました。 (LabDiet 5021; LabDiet、セントルイス、ミズーリ州) 自由に。 マウスは、Alpha-dri® (Shepherd Specialty Papers、ミシガン州カラマズー) 寝具で飼育され、紙小屋 (Bio-Huts、Bio-Serv、ニュージャージー州フレミントン) および ALPHA-twistTM (Shepherd Specialty Papers) で強化されました。 分離者の GF 状態は、糞便 DNA を含むユニバーサル 16S rRNA プライマーを使用した PCR と、37 °C で好気性および嫌気性で 7 日間インキュベートした富栄養培地中での糞便の増殖試験によって毎月評価されました。

この研究で使用されたヒトの糞便サンプルは、ウィスコンシン縦断研究 (WLS) 36,55 の一環として参加者から収集され、-80 °C で保存されました。 WLS データと検体の収集は、UW-Madison 内部審査委員会 (2014-1066、2015-0955) によって承認され、元の研究では書面によるインフォームドコンセントが得られました 55。 私たちのグループの以前の出版物35では、候補WLS標本のサブセットがそれらの異なる細菌群集構造に基づいて選択され、その後盲腸SCFAプロファイルを測定するためにGFマウスに移植されました。 現在の研究では、この情報を使用して 3 つのヒトドナーサンプルを選択しました。ドナー WLS-サンプル-8 からの微生物叢（ここでは DonA と呼びます）。 ドナー WLS-サンプル-1 (ここでは DonB と呼ばれます) およびドナー WLS-サンプル-5 (ここでは DonC と呼ばれます)。 私たちの以前の研究 35 では、DonA、DonB、または DonC が定着した難消化性デンプン 2 型および 4 型、短鎖フラクトオリゴ糖、イヌリン、ペクチンを含むさまざまな繊維を含む半精製飼料を摂取したノトバイオティクス マウスが、異なる食物を蓄積することを発見しました。 SCFAのレベル。 DonA が定着したマウスは、試験したすべてのドナーの中で最も高いレベルの盲腸酪酸塩（約 1.5 mM）を蓄積しましたが、DonB が定着したマウスは有意に低いレベルの盲腸酪酸塩（約 0.6 mM）を蓄積し、DonC が定着したマウスは最も高い盲腸酪酸塩を示しました。プロピオン酸レベル（約 10 mM）および中間酪酸レベル（約 1.0 mM）35。 現在の研究で使用されたすべての WLS 標本は、西洋式の食事を摂取していると自己申告し、過体重 (BMI > 25) であり、糖尿病、がん、または心臓病と診断されていない被験者から採取されました 35,36。 今回の研究では、WLS 参加者の個人情報は研究者に知らされていませんでした。

6週齢で、マウスをAllentown Sentry SPP IVCラックシステム(Allentown Inc.、ニュージャージー州アレンタウン)の換気ケージに移し、5つの発酵性食物から構成される総繊維(wt/wt)が10%含まれる照射FF食餌を与えた。繊維（イヌリン、ペクチン、短鎖 FOS、RS-2 および RS-4、補足図 1、補足表 1）。 各発酵性繊維源の含有率は、純度および灰分に基づいて個別に調整され、各繊維源からの食物繊維の有効含有率 2% が達成されました。 1週間後、GFマウスに、糞便スラリーの単回強制経口投与または共同飼育により、WLS糞便検体（DonA、DonB、またはDonC）の1つからの微生物叢を定着させた。 スラリーは、嫌気チャンバー内で約 200 mg の凍結ヒト糞便を 5 mL の還元済み Mega Media35 中で均質化することにより嫌気的に調製され、その後すぐに嫌気雰囲気でフラッシュされたシリンジを使用してレシピエント マウスに強制経口投与するために使用されました。 GFマウスのサブセットは、4週間前にヒトの糞便を経管栄養法で定着させたマウスと共同飼育することによって定着させた。 コハウジングは、無菌マウスに定着させるための効果的な戦略であり、微生物叢の定着と表現型の伝達の点で強制経口投与に似ています 56,57。 盲腸微生物プロファイルの違いを検出できず、また、同居マウスと強制経口定着マウスとの間で表現型の有意な違いも観察できませんでした（補足図2a、b、補足表2）。 したがって、コロニー形成方法に関係なく、同じ治療グループ内のすべてのマウスを生物学的複製とみなしました。 より多様な繊維源を含む食餌はより多くの微生物の定着を促進するという理論的根拠に基づいて、食餌療法段階の前に定着を安定させるために、マウスをさらに 2 週間 FF 食で維持しました。 食餌療法の際、マウスはFF食を継続するか、非発酵性繊維対照である10％セルロースを含むCC食（補足表1）に切り替えられました。 この研究におけるすべての実験用飼料は、メーカーによって真空パックされ、放射線滅菌されています。 FF 食と CC 食は繊維源のみが異なります。 私たちの実験デザイン（補足図1）の結果、6つの治療グループ（3人のドナーと2つの食事、治療グループあたりn = 7〜10匹のマウス）が得られ、それぞれがケージ効果を説明するために2つの別々のケージに入れられたコホートで実施されました。 11週間の食餌療法の後、4時間絶食させた後、20週齢でマウスを屠殺した。

屠殺後、心臓をＰＢＳ緩衝液で灌流した後、心臓中央部および上行大動脈を横方向に切断して大動脈洞を捕捉した。 この組織は OCT コンパウンドに包埋され、ドライアイス上で凍結され、さらに処理されるまで -80 °C で保存されました。 大動脈洞のアテローム性動脈硬化症プラークを特徴付けるために、埋め込まれた組織をクライオスタット (CM1950、ライカ、イリノイ州ディアパーク) 上で切片化し、大動脈起始部の基部から上行大動脈に向かって近位方向に移動しながら 100 μm 間隔でスライド上に収集しました。 これにより、大動脈洞の 700 μm (大動脈起始部から 0、100、200、300、400、500、600、700 μm) にわたる 8 つの等距離切片 (厚さ 10 μm) を含むスライドが得られました。 各マウスのホルマリン固定スライドを 60% イソプロパノールで 1 分間リンスし、オイルレッド O を使用して脂質を 15 分間染色し、ヘマトキシリンで 1 分間対比染色しました。 アテローム性動脈硬化プラークのマクロファージ浸潤評価は、ホルマリン固定スライド (上記と同じ切片パターン) をマクロファージ抗体 (MOMA-2、1:50; ab33451、Abcam、ケンブリッジ、英国) と一晩インキュベートし、続いて二次抗体 (1 ：４００；ａｂ６７３３、Ａｂｃａｍ）で１時間、そしてストレプトアビジンホースラディッシュペルオキシダーゼ（１：５００；Ｐ０３９７、Ａｇｉｌｅｎｔ、カリフォルニア州サンタクララ）で１５分間。 次いで、切片をＰＢＳで洗浄し、ＤＡＢで１５秒間、ヘマトキシリンで５秒間対比染色した。 すべての染色切片の画像をデジタルでキャプチャし、ImageJ (国立衛生研究所、ベセスダ、メリーランド州) で分析して、脂質陽性領域、総プラーク領域、および MOMA-2 陽性領域を測定しました。 各マウスのプラーク領域および脂質陽性領域は、8 つのセクションすべての平均として表されます。 マクロファージ浸潤を計算するために、目に見える最大の病変を有する 3 つの切片を各マウスから選択し、それらの MOMA-2 陽性領域密度を平均しました。 1 つのサンプルが処理中に失われたため、アテローム性動脈硬化の特性評価のためのサンプル サイズは、治療グループごとに 7 ～ 10 サンプルの範囲でした。

盲腸内容物中のSCFAレベルは、ヘッドスペースガスクロマトグラフィーを使用して測定されました。 サンプルは、20 ～ 150 mg の凍結盲腸内容物を、N μL の水（N は 300 から盲腸内容物の mg を差し引いたものに等しい）を含むバイアル（Restek、ペンシルバニア州ベルフォンテ）に、2 g の NaH2SO4 および 1 mL の冷却水とともに加えることによって調製しました。内部標準として 60 µM 2-ブタノール。 調製物を直ちに GC サンプリングバイアルに密閉し、室温で一晩放置しました。 酢酸塩、プロピオン酸塩、イソ酪酸塩、酪酸塩、イソ吉草酸塩、吉草酸塩の標準物質を既知の濃度 (pH 7.0) で組み合わせ、段階希釈して標準曲線を作成しました。 バイアルを HS-20 ヘッドスペース サンプラー (島津、コロンビア、オハイオ州) にロードし、80 °C で 20 分間振盪し、炎イオン化装置に接続された SH-Stabilwax 30 m カラム (227-36246-01、島津) に注入しました。 CG-2010 Plus GC (島津製作所) 上の検出器。 実行条件は次のとおりです。サンプルバイアルは、注入前に 3 分間 80 kPa で平衡化されました。 注入は、2 mL の注入ループ、150 °C の移送ラインで 12 秒のローディング期間、1:15 のスプリット比、および 1.2 mL/min の N2 カラム流量を使用して実行されました。 カラム温度を 40 °C で 2 分間維持し、その後 20 °C/分の速度で 200 °C まで上昇させ、2 分間保持した後、120 °C まで下げました (-20 °C/分)。 40 °C (-40 °C/分) まで下げ、40 °C で 1 分間保持します。 各標的化合物の曲線下面積は、Shimadzu Lab Solution ソフトウェア (バージョン 5.92) で計算し、サンプル質量と希釈係数で正規化し、標準曲線を使用して μmol・g-1 に変換しました。

イソフルラン誘発麻酔下にあるマウスから、EDTAで洗浄した注射器を使用した心臓穿刺により血液を採取した。 血球を遠心分離によって分離し、血漿を収集し、-80 °C で保存しました。 トリグリセリド、総コレステロール、および高密度リポタンパク質（HDL）コレステロールの血漿レベルは、Waco Diagnostics（それぞれカタログ番号 994-02891、99902601、997-01301; Fujifilm、東京、日本）メーカーの指示に従ってください。

直径 1 mm のジルコニウム ビーズ 1.0 g を含むチューブ内で、室温で 2 分間ビーズビーティング (BioSpec Products、バールズビル、オクラホマ州) を行いながら、TRIzol 試薬 (Invitrogen/Thermo Fisher Scientific、マサチューセッツ州ウォルサム) を使用して、凍結大動脈から全 RNA を抽出しました。 (BioSpec Products)、Qiagen RNeasy ミニキット (Qiagen、ヒルデン、ドイツ) で洗浄しました。 20 μL の反応容量中 125 ng の精製 RNA を使用して、テンプレート cDNA を合成しました。 cDNA を水で 1:1 に希釈し、その後 1 μL を SYBR qPCR Mastermix (Bio-Rad、Hercules、CA) と混合し、適切なプライマー (400 nM) および水と合わせて総反応量を 10 μL にしました。 プライマーのリストを補足表 3 に示します。サイクリングプロトコルは、Mastercycler® nexus (Eppendorf, Hamburg, Germany) を使用して次のように実行しました: 95 °C で 30 秒、続いて 95 °C で 10 秒のサイクルを 35 サイクル、30 秒60℃で。 融解曲線は、65 °C から 95 °C まで 0.5 °C ずつ、5 秒/ステップで測定されました。 すべての反応は 2 回実行し、内在性コントロール (Gapdh) と比較してデルタ-デルタ-Ct 値を計算しました。

ビーズ叩解ステップを含むフェノール-クロロホルム抽出法を使用して、すべてのマウスの盲腸内容物と糞便、さらにはヒトの糞便スラリーから DNA を抽出しました 58。 16S rRNA 遺伝子 (V4) の増幅は、イルミナ アダプターに融合されたフォワード プライマーとリバース プライマーの両方にある固有のバーコード (8 bp) を含む PCR によって行われました 59。 各サンプルからの V4 アンプリコンを組み合わせて、ウィスコンシン大学マディソン バイオテクノロジー センターの DNA シーケンス施設で Illumina MiSeq 実行 (2 × 250 bp、Illumina、サンディエゴ、カリフォルニア州) でのシーケンスに提出しました。 平均サンプル読み取り数の 20% 未満のサンプルは除外され、結果として 4 つのサンプルがさらなる分析から除外されました。 残りのサンプルは 33,869 ～ 133,538 のペアエンド リードの範囲で、サンプルあたり平均 77,704 のペアエンド リードでした。 Qiime2 (バージョン 2019.10) を使用して、16S rRNA リードからアンプリコン配列バリアント (ASV) テーブルと分類テーブルを生成しました。 逆多重化されたリードは、Qiime2 DADA2 プラグイン 60 を使用して品質を確保するためにトリミングおよびフィルター処理されました。 Qiime2 の Naïve Bayes 分類器を使用して、ASV に SILVA 参照データベース 61 (バージョン 132) で属レベルのアノテーションを付けました。 その後のすべての分析は R で実行されました。ASV レベルの特徴数は、相対存在量に変換することで正規化されました。 ASV は、すべての盲腸サンプルにわたって平均相対存在量が少なくとも 0.0001 であるもののみを含むようにフィルター処理されました。 属レベルの分析では、カットオフはすべてのサンプルにわたる平均相対存在量 0.0005 に設定されました。 これらのカットオフは、糞便サンプルの ASV および属のプロファイル (ヒト接種材料の糞便スラリーおよび食事療法前のマウスの糞便) にも適用されました。 生着効率は、ドナーまたはドナー/食餌群ごとに少なくとも 1 匹の動物の処理前のマウス糞便で検出された特徴の数を、ドナー糞便スラリーで検出された特徴の数で割ったものとして計算されました。 陽性検出は、特定のサンプル内で相対存在量が 0.0001 を超えることが判明した任意の特徴 (ASV または属) として定義されました。

治療群あたり 5 匹のマウスの盲腸内容物から単離されたゲノム DNA をメタゲノム解析に使用しました。 ベンダーのプロトコルに従って Illumina TruSeq PCR フリー キットを使用してライブラリーを調製し、ウィスコンシン大学バイオテクノロジー センターの DNA 配列決定施設で配列決定しました。 すべてのサンプルは、単一の NovaSeq6000 2 × 150 S4 フローセル レーンで実行されました。 得られた配列は、Trimmomatic (バージョン 0 ～ 39) を使用して品質を確保するためにトリミングされ、bowtie2 (バージョン 2.3.4) を使用して参照宿主ゲノム (ハツカネズミ GRCm38_Rel98) に対してアラインメントされ、ホスト リードが削除されました (平均ホスト アラインメント率は 5.3%)。高品質の非ホスト読み取り。 クリーニングにより、最終的にサンプルあたり平均 2,940 万回のペアエンド読み取りが行われました。

ホスト配列のトリミングおよび除去後に残ったリードは、単一の fastq ファイルに連結され、機能注釈のために HUMAnN3 (バージョン 3.0.0α4) に供給されました。 これにより、キロベースあたりのリード数で表した UniRef9062 遺伝子ファミリー存在量表と、各マウスの微生物分類群の相対存在量表が得られました。 UniRef90 遺伝子ファミリーの存在量テーブルは、human_regroup_table 関数と human_renorm_table 関数を使用して KO counts-per-million (CPM) 存在量テーブルに変換されました。 サンプルの少なくとも 25% に存在する KO について、差次存在量分析を実施しました。

各サンプルの CAZyme プロファイルは、run_dbcan (バージョン 2.0.11) を使用して予測されました。 複数の k-mer サイズ (metaspades.py -k 21、33、55、77) を持つ metaSPAdes (バージョン 3.14.0) を使用して、クリーンな (トリミング、ホストなし) リードをコンティグにアセンブルしました。 500 bp より短いコンティグは、さらなる処理から廃棄されました。 オープン リーディング フレーム (ORF、つまり微生物のメタ遺伝子) は、デフォルト パラメーターの隠れマルコフ モデル (HMM) を使用して、Prodigal (バージョン 2.6.3) を介して組み立てられたコンティグから予測されました。 100 bp より短い予測遺伝子はすべて、さらなる処理から除外されました。 ヌクレオチド ORF 配列はアミノ酸配列に変換され、CAZyme プロファイルを予測するための run_dbcan (バージョン 2.0.11) の入力として使用されました。 CAZyme アノテーションは、ORF が 2 つ以上のツール (DIAMOND、HMMER、Hotpep) によってアノテーション付けされている場合に受け入れられました。 これにより、CAZyme データベース内の各 CAZyme ファミリーの有無を示す表が作成されました。 CAZyme 存在量を推定するために、各 CAZyme ファミリーには、Prodigal が予測した関連する ORF の count-per-million (CPM) 値が割り当てられました。 複数の CAZyme が同じ ORF から予測された場合、それらにはすべて ORF の CPM 値が割り当てられました。

PCoA プロットと多様性測定は、R の phyloseq (バージョン 1.40.0) パッケージを使用して 16S rRNA ASV プロファイルを使用して生成されました。すべてのペアワイズ PERMANOVA テストは、9999 順列のペアワイズ Adonis (バージョン 0.4) R パッケージを使用して、各ドナー グループ内の食事グループ間で実施されました。 。 16S rRNA アンプリコン分類、ショットガン メタゲノム KO 存在量、およびショットガン メタゲノム CAZyme 存在量の特徴レベルの差次存在量解析は、MaAsLin 2 (バージョン 1.10.0) R パッケージ内の MaAsLin 2 機能をデフォルト設定で使用して実施されました41。 KO 経路の濃縮を評価するために、FF 給餌によって有意に上方制御された KO のセット (MaAsLin 2 の差次存在量、調整済み P < 0.1) をドナー グループごとに生成し、MicrobiomeAnalyistR (バージョン 0.0.0.9000) 内の PerformKOEnrichAnalysis_KO01100 関数の入力として使用しました。デフォルトパラメータを備えた R のパッケージ。 これにより、各ドナーグループ内の FF 給餌マウスで有意に (P < 0.05) 過剰発現した KEGG 経路のリストが得られました。 CAZyme ファミリーは、方向 (効果サイズの絶対値) に関係なく、各ドナー グループ内の MaAsLin 2 効果サイズで順序付けされた CAZyme の上位 10% に属している場合、高度に差異があるとみなされました。

特に明記しない限り、平均値の比較は、各ドナーグループ内の食餌グループ間の両側ウィルコクソン順位和検定を使用して行われました。 食事間で有意に異なる分散を有することが判明したアテローム性動脈硬化症プラーク（サイズ、脂質含量、マクロファージ浸潤）および盲腸SCFAレベルの比較を除いて、すべての平均値検定（Leveneの検定、P > 0.05）で等しい分散が決定されました（Leveneの検定、P<0.05）。 0.05）。 CAZymeと盲腸SCFAレベルの間の相関関係を、すべてのマウスを使用して実施し、スピアマンの順位相関係数を計算した。 PERMANOVA の P 値調整は Bonferroni 法を使用して行われ、他のすべての調整済み P 値は Benjamini-Hochberg 法を使用して計算されました。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Research レポートの概要をご覧ください。

この研究で報告された配列データは、欧州ヌクレオチド アーカイブ (ENA) で研究アクセッション番号 PRJEB58699 で入手できます。

この研究で使用されているコードは、リクエストに応じて入手できます。

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著者らは、食事療法について支援してくれた Barbara Mickelson 博士 (Envigo) に感謝します。 また、配列決定およびサポート サービスを提供していただいたウィスコンシン大学マディソン バイオテクノロジー センターの DNA 配列決定施設にも感謝します。 計算リソース、サポート、支援を提供してくださったウィスコンシン大学マディソン校コンピューターサイエンス学部ハイスループットコンピューティングセンター（CHTC）に感謝します。 この研究は、NIH HL144651 (FER)、HL148577 (FER)、および EB030340 (FER) からの助成金によって部分的に支援されました。 この研究は、Leducq Foundation (17CVD01) からの Transatlantic Networks of Excellence Award の助成金によっても支援されました。 ERH は、代謝および栄養トレーニング プログラム NIH T32 (DK007665) およびウィスコンシン大学マディソン食品研究所 (ロバート H. およびキャロル L. ダイベル プロバイオティクス研究における優秀大学院フェローシップ) によって一部支援されました。 T.-WLC は、ルース L. カーシュシュタイン国立研究サービス賞 T32 HL007936 に基づき、国立心肺血液研究所からウィスコンシン大学マディソン心臓血管研究センターに贈られ、国立衛生研究所によって支援されました。

微生物学博士課程トレーニングプログラム、ウィスコンシン大学マディソン校、米国ウィスコンシン州マディソン

エヴァン・R・ハッチソン

ウィスコンシン大学マディソン校細菌学部、米国ウィスコンシン州マディソン

エヴァン・R・ハッチソン、笠原和幸、チージュン・チャン、ユージン・I・ビバス、ツウェン・L・クロス、フェデリコ・E・キング

南洋理工大学リー・コンチアン医学部、シンガポール、シンガポール

Kazuyuki Kasahara

パデュー大学栄養科学部、ウェストラファイエット、インディアナ州、米国

ツウェン・L・クロス

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この研究は ERH、T.-WLC、および FER によって考案されました。 ERH、KK、および EIV はマウス実験を実施し、組織を収集しました。 ERH はアテローム性動脈硬化の表現型の分析を実施しました。 ERH と QZ は腸管メタゲノム解析を実施しました。 ERH と FER が原稿を作成しました。 この原稿は著者全員によって承認されました。

フェデリコ E. レイへの通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

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転載と許可

Hutchison、ER、Kasahara、K.、Zhang、Q. 他。 さまざまな腸内微生物群集が定着したマウスのアテローム性動脈硬化に対する食物繊維の種類の影響を分析します。 npj バイオフィルム マイクロバイオーム 9、31 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41522-023-00402-7

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受信日: 2022 年 12 月 30 日

受理日: 2023 年 5 月 18 日

公開日: 2023 年 6 月 3 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41522-023-00402-7

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